347 12.7*1.24 มม. ท่อขดสแตนเลส, กลไกระดับโมเลกุลของการควบแน่นของไฟฟ้าสถิตแบบซิงโครนัสและการรวมตัวกันของα-synuclein และ tau

ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comคุณกำลังใช้เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่มีการรองรับ CSS แบบจำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
แถบเลื่อนแสดงสามบทความต่อสไลด์ใช้ปุ่มย้อนกลับและปุ่มถัดไปเพื่อเลื่อนไปตามสไลด์ หรือใช้ปุ่มตัวควบคุมสไลด์ที่ส่วนท้ายเพื่อเลื่อนไปตามแต่ละสไลด์

ข้อมูลจำเพาะของท่อสแตนเลส 347

347 12.7*1.24 มม. ท่อขดสแตนเลส

เส้นผ่านศูนย์กลางภายนอก: OD 6.00 มม. จนถึง 914.4 มม. OD, ขนาดสูงสุด 24” NB มีจำหน่ายในสต๊อก, ท่อเหล็กขนาด OD มีจำหน่ายในสต๊อก

ช่วงความหนาของท่อ SS 347: 0.3 มม. – 50 มม., SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S ฯลฯ (0.5-12 มม.) หรือขนาดที่ไม่ปกติเพื่อปรับแต่งตามความต้องการ

ประเภท: SS 347 ท่อไร้รอยต่อ |ท่อ SS 347 ERW |ท่อเชื่อม SS 347 |ท่อประดิษฐ์ SS 347 |ท่อ SS 347 CDW, ท่อ LSAW / เชื่อมตะเข็บ / วาดใหม่

แบบฟอร์ม: ท่อกลม / ท่อ SS 347, ท่อ / ท่อสี่เหลี่ยม SS 347, ท่อ / ท่อสี่เหลี่ยม SS 347, ท่อ / ท่อสี่เหลี่ยม SS 347, ท่อขด SS 347, รูปร่าง SS 347 "U", คอยล์เค้กแพนเค้ก SS 347, ท่อไฮดรอลิก SS 347

ความยาว: สุ่มเดี่ยว, สุ่มคู่ & ความยาวที่ต้องการ: ปลายธรรมดา, ปลายเอียง, เหยียบ

การป้องกันปลาย: ฝาพลาสติก |เสร็จสิ้นภายนอก: 2B, ฉบับที่ 4, ฉบับที่ 1, ฉบับที่ 8 กระจกเงาสำหรับท่อสแตนเลส, เสร็จสิ้นตามความต้องการของลูกค้า

เงื่อนไขการจัดส่ง: อบอ่อนและดอง, ขัด, อบอ่อน, ดึงเย็น

การตรวจสอบ รายงานการทดสอบ: ใบรับรองการทดสอบโรงงาน, EN 10204 3.1, รายงานทางเคมี, รายงานทางกล, รายงานการทดสอบ PMI, รายงานการตรวจสอบด้วยภาพ, รายงานการตรวจสอบโดยบุคคลที่สาม, รายงานห้องปฏิบัติการที่ได้รับอนุมัติจาก NABL, รายงานการทดสอบแบบทำลายล้าง, รายงานการทดสอบแบบไม่ทำลาย

การบรรจุ: บรรจุในกล่องไม้ ถุงพลาสติก เหล็กเส้นที่แถมมา หรือตามคำขอของลูกค้า

พิเศษ: สามารถผลิตขนาดและข้อมูลจำเพาะนอกเหนือจากข้างต้นได้ตามคำขอ

ช่วงขนาดท่อ SS 347:NB 1/2 นิ้ว OD ถึง 24 นิ้ว

ASTM A312 347: ท่อออสเทนนิติกแบบไม่มีรอยต่อและตะเข็บตรงมีไว้สำหรับการใช้งานที่อุณหภูมิสูงและมีฤทธิ์กัดกร่อนทั่วไปไม่อนุญาตให้ใช้โลหะเติมระหว่างการเชื่อม

ASTM A358 347: ท่อออสเทนนิติกเชื่อมฟิวชั่นด้วยไฟฟ้าสำหรับการให้บริการที่มีฤทธิ์กัดกร่อนและ/หรืออุณหภูมิสูงโดยทั่วไปแล้วจะมีการผลิตท่อขนาดไม่เกิน 8 นิ้วตามข้อกำหนดนี้เท่านั้นอนุญาตให้เติมโลหะเติมระหว่างการเชื่อม

ASTM A790 347: ท่อเฟอร์ริติก/ออสเทนนิติก (ดูเพล็กซ์) รอยต่อแบบไม่มีรอยต่อและตะเข็บตรงสำหรับบริการที่มีฤทธิ์กัดกร่อนทั่วไป โดยเน้นเป็นพิเศษในเรื่องความต้านทานต่อการแตกร้าวจากการกัดกร่อนจากความเค้น

ASTM A409 347: ฟิวชั่นไฟฟ้าแบบตะเข็บตรงหรือตะเข็บเกลียวเชื่อมท่อผนังเบาออสเทนนิติกเส้นผ่านศูนย์กลางขนาดใหญ่ในขนาด 14” ถึง 30” พร้อมผนัง Sch5S และ Sch 10S สำหรับการกัดกร่อนและ/หรือสูง

ASTM A376 347: ท่อออสเทนนิติกไร้รอยต่อสำหรับการใช้งานที่อุณหภูมิสูง

ASTM A813 347: ท่อออสเทนนิติกแบบตะเข็บเดี่ยวหรือแบบเชื่อมคู่สำหรับงานที่มีอุณหภูมิสูงและมีฤทธิ์กัดกร่อนทั่วไป

ASTM A814 347: ท่อออสเทนนิติกเชื่อมงานเย็นสำหรับอุณหภูมิสูงและการกัดกร่อนทั่วไป

องค์ประกอบทางเคมีของท่อสแตนเลส 347H

คุณสมบัติทางกลของท่อสแตนเลส 347H

คุณสมบัติทางกายภาพของท่อสแตนเลส 347H

เกรดเทียบเท่าสำหรับท่อสเตนเลส 347H

การรวมตัวของอะไมลอยด์อัลฟา-ซินนิวคลิน (αS) เป็นจุดเด่นของโรคพาร์กินสันและโรคซินนิวคลีอิโนพาทีอื่น ๆเมื่อเร็วๆ นี้ เทาโปรตีนที่มักเกี่ยวข้องกับโรคอัลไซเมอร์มีความเกี่ยวข้องกับพยาธิวิทยาของ αS และพบว่ามีการแปลร่วมในการรวมที่อุดมด้วย αS แม้ว่ากลไกระดับโมเลกุลของการแข็งตัวของโปรตีนทั้งสองยังไม่ชัดเจนเรารายงานที่นี่ว่าเฟส αS แยกออกเป็นคอนเดนเสทของเหลวผ่านการควบแน่นที่ซับซ้อนด้วยไฟฟ้าสถิตด้วยโพลีเปปไทด์ที่มีประจุบวก เช่น เอกภาพขึ้นอยู่กับความสัมพันธ์ของ αS สำหรับโพลีแคตชันและอัตราการสูญเสียเวเลนซ์ของเครือข่ายการจับตัวเป็นลิ่ม ลิ่มเลือดเกิดเจลหรือรวมตัวกันอย่างรวดเร็วตามด้วยการรวมตัวกันของอะไมลอยด์ที่ช้าด้วยการรวมชุดเทคนิคทางชีวฟิสิกส์ขั้นสูงเข้าด้วยกัน เราจึงสามารถระบุลักษณะการแยกเฟส αS/Tau ของของเหลว-ของเหลว และระบุปัจจัยสำคัญที่นำไปสู่การก่อตัวของมวลรวมที่ต่างกันซึ่งมีโปรตีนทั้งสองในคอนเดนเสทโปรตีนเหลว
นอกเหนือจากการแบ่งช่องเมมเบรนแล้ว การแยกเชิงพื้นที่ในเซลล์ยังสามารถทำได้โดยการก่อตัวของวัตถุหนาแน่นคล้ายของเหลวที่อุดมด้วยโปรตีน ที่เรียกว่าคอนเดนเสทหรือหยดทางชีวโมเลกุล ผ่านกระบวนการที่เรียกว่าการแยกเฟสของเหลว-ของเหลว (LLPS)หยดเหล่านี้เกิดขึ้นจากปฏิกิริยาระหว่างเวลาหลายรูปแบบ โดยปกติระหว่างโปรตีนหรือโปรตีนกับ RNA และทำหน้าที่ต่างๆ มากมายในระบบสิ่งมีชีวิตเกือบทั้งหมดโปรตีนที่สามารถ LLP จำนวนมากแสดงลำดับของความซับซ้อนต่ำซึ่งมีความผิดปกติอย่างมากในธรรมชาติและในการก่อตัวของคอนเดนเสททางชีวโมเลกุลการศึกษาทดลองจำนวนมากเผยให้เห็นถึงธรรมชาติที่ยืดหยุ่น มักไม่เป็นระเบียบ และหลากหลายของโปรตีนที่ประกอบเป็นคอนเดนเสทที่มีลักษณะคล้ายของเหลวเหล่านี้ แม้ว่าจะไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับปัจจัยกำหนดระดับโมเลกุลจำเพาะที่ควบคุมการเติบโตและการสุกเต็มที่ของคอนเดนเสทเหล่านี้ให้มีลักษณะคล้ายของแข็งมากขึ้น สถานะ..
ข้อมูลใหม่สนับสนุนสมมติฐานที่ว่า LLPS ที่ขับเคลื่อนด้วยโปรตีนที่ผิดปกติและการเปลี่ยนแปลงของหยดให้เป็นโครงสร้างแข็งอาจเป็นเส้นทางของเซลล์ที่เกี่ยวข้องซึ่งนำไปสู่การก่อตัวของมวลรวมที่เป็นพิษที่ไม่ละลายน้ำซึ่งมักเป็นจุดเด่นของโรคความเสื่อมโปรตีนที่ไม่เป็นระเบียบจากภายใน (IDPs) ที่เกี่ยวข้องกับ LLPS จำนวนมาก ซึ่งมักจะมีประจุสูงและมีความยืดหยุ่น มีความเกี่ยวข้องมานานแล้วกับการเสื่อมของระบบประสาทผ่านกระบวนการรวมตัวของอะไมลอยด์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง IDP ชีวโมเลกุลที่ควบแน่น เช่น FUS7 หรือ TDP-438 หรือโปรตีนที่มีโดเมนที่มีความซับซ้อนต่ำขนาดใหญ่ เช่น hnRNPA19 ได้แสดงให้เห็นว่ามีอายุมากขึ้นจนกลายเป็นรูปแบบเจลหรือแม้แต่ของแข็งผ่านกระบวนการที่เรียกว่าฟลูอิไดเซชันสารประกอบ.ไปสู่การเปลี่ยนสถานะของแข็ง (LSPT) เป็นฟังก์ชันของเวลาหรือเพื่อตอบสนองต่อการปรับเปลี่ยนหลังการแปลบางอย่างหรือการกลายพันธุ์ที่มีนัยสำคัญทางพยาธิวิทยา1,7
IDP อื่นที่เกี่ยวข้องกับ LLPS ในร่างกาย คือ Tau ซึ่งเป็นโปรตีนที่ไม่เป็นระเบียบที่เกี่ยวข้องกับ microtubule ซึ่งการรวมตัวของอะไมลอยด์มีส่วนเกี่ยวข้องในโรคอัลไซเมอร์ แต่เพิ่งมีส่วนเกี่ยวข้องกับโรคพาร์กินสัน (PD) และโปรตีโอพาทีนิวเคลียร์ซินแนปติกอื่น ๆ 11, 12, 13 มีความสัมพันธ์กันเอกภาพได้รับการแสดงให้เห็นว่าแยกตัวออกจากสารละลาย / ไซโตพลาสซึมตามธรรมชาติเนื่องจากปฏิกิริยาทางไฟฟ้าสถิตที่ดี ส่งผลให้เกิดการก่อตัวของหยดที่เสริมสมรรถนะด้วยเอกภาพซึ่งเรียกว่า coacervates ไฟฟ้าสถิตนอกจากนี้ยังพบว่าปฏิสัมพันธ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงประเภทนี้เป็นแรงผลักดันเบื้องหลังคอนเดนเสททางชีวโมเลกุลจำนวนมากในธรรมชาติในกรณีของเทาโปรตีน การรวมกลุ่มด้วยไฟฟ้าสถิตสามารถเกิดขึ้นได้โดยการรวมกลุ่มอย่างง่าย ซึ่งในบริเวณที่มีประจุตรงข้ามกันของโปรตีนกระตุ้นให้เกิดกระบวนการตัดแยก หรือโดยการรวมกลุ่มที่ซับซ้อนผ่านทางอันตรกิริยากับโพลีเมอร์ที่มีประจุลบ เช่น RNA
เมื่อเร็ว ๆ นี้ α-synuclein (αS) ซึ่งเป็น amyloid IDP ที่เกี่ยวข้องใน PD และโรคทางระบบประสาทอื่น ๆ ที่รู้จักกันในชื่อ synucleinopathy ได้รับการแสดงให้เห็นในแบบจำลองเซลล์และสัตว์ มีความเข้มข้นในโปรตีนคอนเดนเสทที่มีพฤติกรรมคล้ายของเหลวการศึกษา ในหลอดทดลอง แสดงให้เห็นว่า αS ผ่าน LLPS โดยการรวมตัวอย่างง่าย ๆ ผ่านปฏิกิริยาที่ไม่ชอบน้ำเป็นส่วนใหญ่ แม้ว่ากระบวนการนี้ต้องการความเข้มข้นของโปรตีนที่สูงเป็นพิเศษและเวลาในการฟักตัวที่ยาวนานผิดปรกติไม่ว่าคอนเดนเสทที่ประกอบด้วย αS ที่สังเกต ในวิฟ จะถูกสร้างขึ้นโดยกระบวนการ LLPS นี้หรืออื่น ๆ หรือไม่ยังคงเป็นปัญหาสำคัญที่ยังไม่ได้รับการแก้ไขในทำนองเดียวกัน แม้ว่าการรวมตัวของ αS amyloid จะถูกสังเกตในเซลล์ประสาทใน PD และ synucleinopathies อื่น ๆ กลไกที่แน่นอนที่ αS ผ่านการรวมตัวของ amyloid ในเซลล์ยังคงไม่ชัดเจน เนื่องจากการแสดงออกที่มากเกินไปของโปรตีนนี้ดูเหมือนจะไม่ได้กระตุ้นกระบวนการนี้ด้วยตัวมันเองมักจำเป็นต้องมีความเสียหายของเซลล์เพิ่มเติม โดยบอกว่าจำเป็นต้องมีตำแหน่งเซลล์หรือสภาพแวดล้อมระดับจุลภาคบางแห่งสำหรับการสร้างนิวเคลียสของชุดประกอบ αS อะไมลอยด์ในเซลล์สภาพแวดล้อมของเซลล์หนึ่งที่มีแนวโน้มที่จะรวมกลุ่มเป็นพิเศษอาจเป็นภายในของโปรตีนคอนเดนเสท 23
สิ่งที่น่าสนใจคือ αS และเทาถูกค้นพบร่วมกันในการรวมตัวของโรคที่มีลักษณะเฉพาะในมนุษย์ที่เป็นโรคพาร์กินสันและโรคซินนิวคลีอิโนพาธีอื่น ๆ 24,25 และการทดลองได้รายงานความสัมพันธ์ทางพยาธิวิทยาที่เสริมฤทธิ์กันระหว่างโปรตีนทั้งสอง 26,27 ซึ่งเสนอแนะถึงความสัมพันธ์ที่เป็นไปได้ระหว่างการรวมตัวของ αS และ เอกภาพในโรคทางระบบประสาทการเจ็บป่วย.พบว่า αS และ tau มีปฏิสัมพันธ์และส่งเสริมการรวมตัวของกันและกัน ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย 28,29 และมวลรวมต่างกันที่ประกอบด้วยโปรตีนทั้งสองนี้ถูกสังเกตในสมองของผู้ป่วยที่มีอาการซินนิวคลีโอโนพาที 30อย่างไรก็ตาม ยังไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับพื้นฐานระดับโมเลกุลของปฏิสัมพันธ์ระหว่าง αS และเทา และกลไกของการรวมตัวร่วมของมันมีรายงานว่า αS มีปฏิกิริยากับเอกภาพผ่านแรงดึงดูดไฟฟ้าสถิตระหว่างบริเวณปลาย C ของ αS ที่มีประจุลบสูง และบริเวณกลางที่อุดมด้วยโพรลีนของเทา ซึ่งอุดมด้วยสารตกค้างที่มีประจุบวกด้วย
ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่า αS สามารถแยกตัวออกเป็นหยดได้จริง ๆ ผ่านการควบแน่นที่ซับซ้อนด้วยไฟฟ้าสถิตเมื่อมีโปรตีนเทา ตรงกันข้ามกับอันตรกิริยากับโพลีเปปไทด์ที่มีประจุบวกอื่น ๆ เช่น โพลี-L-ไลซีน (pLK) และในกระบวนการนี้αS ทำหน้าที่เป็นโมเลกุลโครงสำหรับเครือข่ายหยดเราได้ระบุความแตกต่างที่เห็นได้ชัดเจนในกระบวนการสุกของ coacervates αS แบบไฟฟ้าสถิต ซึ่งสัมพันธ์กับความแตกต่างในความจุและความแข็งแรงของปฏิกิริยาของโปรตีนที่เกี่ยวข้องในเครือข่าย coacervateสิ่งที่น่าสนใจคือเราสังเกตการรวมตัวของโปรตีน αS และ tau amyloid ใน coacervates ของเหลวที่มีอายุยืนยาว และระบุปัจจัยสำคัญบางประการที่นำไปสู่การรวมตัวร่วมกันของโปรตีนทั้งสองนี้ใน coacervates ดังกล่าวที่นี่เราอธิบายรายละเอียดกระบวนการนี้ ซึ่งเป็นกลไกระดับโมเลกุลที่เป็นไปได้ซึ่งเป็นรากฐานของการรวมตัวกันของโปรตีนสองชนิดในการรวมเฉพาะโรค
αS มีหางขั้ว C ที่มีประจุลบสูงที่ pH เป็นกลาง (รูปที่ 1a) และเราตั้งสมมติฐานว่าสามารถรับ LLPS ผ่านการควบแน่นของสารเชิงซ้อนไฟฟ้าสถิตด้วยโมเลกุลโพลีเปปไทด์ที่ไม่เป็นระเบียบแบบโพลีไอออนิกเราใช้โพลี-L-ไลซีน (pLK) 100 สารตกค้างเป็นโมเลกุลแบบจำลองเริ่มต้นเนื่องจากมีลักษณะโพลีเมอร์ที่มีประจุบวกและไม่เป็นระเบียบที่ pH เป็นกลาง 32 อันดับแรก เรายืนยันว่า pLK โต้ตอบกับโดเมน Ct ของ αS ผ่านโซลูชัน NMR สเปกโทรสโกปี (รูปที่ 1b) โดยใช้ αS ที่มีป้ายกำกับ 13C/15N โดยมีอัตราส่วนโมลาร์ αS:pLK ที่เพิ่มขึ้นปฏิสัมพันธ์ของ pLK กับโดเมน Ct ของ αS แสดงออกในการรบกวนการเปลี่ยนแปลงทางเคมีและการลดลงของความเข้มสูงสุดในบริเวณนี้ของโปรตีนที่น่าสนใจคือเมื่อเราผสม αS กับ pLK ที่ความเข้มข้น αS ประมาณ5–25 µM ต่อหน้าโพลีเอทิลีนไกลคอล (5–15% PEG-8) (บัฟเฟอร์ LLPS ทั่วไป: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) เราดำเนินการผ่านเขตข้อมูลกว้างของการสร้างโปรตีนทันที .สังเกตหยดโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (WF) และกล้องจุลทรรศน์สนามสว่าง (BF) (รูปที่ 1c)หยดขนาด 1-5 µm ที่ประกอบด้วย αS เข้มข้น (เพิ่ม αS ที่มีป้ายกำกับ AlexaFluor488 1 µM, AF488-αS) คุณสมบัติทางไฟฟ้าสถิตสามารถได้มาจากความต้านทานต่อ 1,6-เฮกเซนไดออล (1,6-HD) 10% และความไวต่อ ความเข้มข้นของ NaCl ที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 1c)ลักษณะคล้ายของเหลวของ coacervates ของคอมเพล็กซ์ไฟฟ้าสถิต αS/pLK แสดงให้เห็นโดยความสามารถในการหลอมรวมภายในมิลลิวินาที (รูปที่ 1d)เมื่อใช้การวัดความขุ่น เราวัดปริมาณการก่อตัวของหยดภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ ยืนยันลักษณะไฟฟ้าสถิตของอันตรกิริยาหลักที่เกี่ยวข้องกับความเสถียร (รูปที่ 1e) และประเมินผลกระทบของอัตราส่วนโพลีเมอร์ต่างๆ ในกระบวนการ LLPS (รูปที่ 1f)แม้ว่าการก่อตัวของหยดจะสังเกตเห็นได้ในอัตราส่วนโพลีเมอร์ที่หลากหลาย แต่กระบวนการนี้มีประโยชน์มากเมื่อ pLK เกินกว่า αSLLP ยังถูกสังเกตโดยใช้สารแทนที่ที่แตกต่างกันทางเคมี dextran-70 (70 kDa) หรือใช้รูปแบบตัวอย่างที่หลากหลาย รวมถึงหยดแบบเลื่อนแก้ว ช่องไมโครเพลทของวัสดุหลากหลายชนิด Eppendorf หรือเส้นเลือดฝอยควอตซ์
การแสดงแผนผังของบริเวณโปรตีนที่แตกต่างกันในตัวแปร WT-αS และ ΔCt-αS ที่ใช้ในการศึกษานี้โดเมนที่ปลาย N แบบแอมฟิพาทิก, บริเวณที่ก่อตัวเป็นอะไมลอยด์ที่ไม่ชอบน้ำ (NAC) และโดเมนที่ปลาย C ที่มีประจุลบจะแสดงเป็นสีน้ำเงิน สีส้ม และสีแดง ตามลำดับแผนที่ Net Charge Per Residual (NCPR) ของ WT-αS จะแสดงขึ้นb การวิเคราะห์ NMR ของอันตรกิริยาของ αS/pLK ในกรณีที่ไม่มีกลุ่มโมเลกุลขนาดใหญ่เมื่อความเข้มข้นของ pLK เพิ่มขึ้น (อัตราส่วนฟันกราม αS:pLK ที่ 1:0.5, 1:1.5 และ 1:10 จะแสดงเป็นสีเขียวอ่อน เขียว และเขียวเข้ม ตามลำดับ)c Coacervate αS/pLK (อัตราส่วนโมล 1:10) ที่ 25 µM (1 µM ที่มีป้ายกำกับ AF488 αS หรือ pLK ที่มีป้ายกำกับ Atto647N สำหรับการถ่ายภาพ WF) ในบัฟเฟอร์ LLPS (บนสุด) หรือเสริมด้วย NaCl 500 mM (ซ้ายล่าง) หรือหลัง 10 % 1,6-เฮกเซนไดออล (1,6-HD; ล่างขวา)สเกลบาร์ = 20 µmd ภาพถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ตัวแทนของการหลอมรวมหยด BF ของ αS / pLK (อัตราส่วนฟันกราม 1:10) ที่ความเข้มข้น 25 μM;ลูกศรบ่งชี้การรวมหยดแต่ละหยด (ลูกศรสีแดงและสีเหลือง) เข้ากับหยดใหม่ (ลูกศรสีส้ม) ภายใน 200 มิลลิวินาที)สเกลบาร์ = 20 µme การกระเจิงของแสง (ที่ 350 นาโนเมตร) การรวมกลุ่ม αS/pLK ในบัฟเฟอร์ LLPS ก่อนและหลังการเติม NaCl 500 มิลลิโมลาร์ หรือ 10% 1,6-HD ที่ 25 µM αS (การจำลองตัวอย่าง N = 3 รายการ ค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานยังระบุด้วย)f ภาพ BF (ด้านบน) และการวิเคราะห์การกระเจิงของแสง (ที่ 350 นาโนเมตร, ด้านล่าง) ของการรวม αS/pLK ที่ 25 μM αS ด้วยการเพิ่มอัตราส่วนโมล αS:pLK (N = 3 ตัวอย่างจำลองซ้ำ, ค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานยังระบุด้วย)สเกลบาร์ = 10 µmแถบมาตราส่วนบนรูปภาพเดียวจะระบุขนาดของรูปภาพทั้งหมดในแผงเดียวข้อมูลดิบมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลดิบ
จากการสังเกตของเราเกี่ยวกับการควบแน่นที่ซับซ้อนด้วยไฟฟ้าสถิต αS/pLK และการสังเกตก่อนหน้านี้ของ αS ในฐานะโมเลกุลไคลเอนต์ของคอนเดนเสทเทา/อาร์เอ็นเอผ่านการโต้ตอบโดยตรงกับ tau31 เราตั้งสมมติฐานว่า αS และเทาสามารถแยกร่วมกับตัวทำละลายในกรณีที่ไม่มี RNA การควบแน่นผ่านคอมเพล็กซ์ไฟฟ้าสถิต และ αS คือโปรตีนนั่งร้านใน αS/Tau coacervates (ดูการกระจายประจุของเอกภาพในรูปที่ 2e)เราสังเกตว่าเมื่อ 10 μM αS และ 10 μM Tau441 (ประกอบด้วย 1 μM AF488-αS และ 1 μM Atto647N-Tau ตามลำดับ) ถูกผสมเข้าด้วยกันในบัฟเฟอร์ LLPS พวกมันจะสร้างมวลรวมโปรตีนที่มีโปรตีนทั้งสองอย่างง่ายดาย เมื่อมองด้วยกล้องจุลทรรศน์ WF(รูปที่ 2a)การรวมตัวกันของโปรตีนทั้งสองในหยดได้รับการยืนยันด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (CF) (รูปที่ 1a เพิ่มเติม)สังเกตพฤติกรรมที่คล้ายกันเมื่อใช้ dextran-70 เป็นตัวแทนการรวมตัว (รูปที่ 1c เพิ่มเติม)การใช้ PEG หรือเดกซ์แทรนที่มีป้ายกำกับ FITC เราพบว่าตัวแทนการอัดแน่นทั้งสองมีการกระจายเท่า ๆ กันในกลุ่มตัวอย่าง โดยไม่แสดงการแยกหรือการเชื่อมโยง (รูปที่ 1 เพิ่มเติม)แต่มันชี้ให้เห็นว่าในระบบนี้พวกเขาส่งเสริมการแยกเฟสผ่านเอฟเฟกต์การอัดแน่นของโมเลกุลระดับโมเลกุล เนื่องจาก PEG เป็นตัวแทนการอัดแน่นที่มีความเสถียรเป็นพิเศษดังที่เห็นในระบบ LLP อื่น ๆหยดที่อุดมด้วยโปรตีนเหล่านี้ไวต่อ NaCl (1 M) แต่ไม่ถึง 1,6-HD (10% v / v) ยืนยันคุณสมบัติทางไฟฟ้าสถิต (รูปที่ 2a, b เสริม)พฤติกรรมของของไหลได้รับการยืนยันโดยการสังเกตเหตุการณ์หยดที่รวมเป็นมิลลิวินาทีโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ BF (รูปที่ 2b)
ภาพกล้องจุลทรรศน์ Confocal (CF) ของ αS / Tau441 coacervates ในบัฟเฟอร์ LLPS (10 μM ของโปรตีนแต่ละชนิด, 0.5 μM ของ αS ที่มีป้ายกำกับ AF488 และ Tau441 ที่มีป้ายกำกับ Atto647N)b รูปภาพคอนทราสต์การรบกวนเชิงอนุพันธ์ที่เป็นตัวแทน (DIC) ของเหตุการณ์ฟิวชั่นหยดαS / Tau441 (10 μM สำหรับแต่ละโปรตีน)c แผนภาพเฟสตามการกระเจิงของแสง (ที่ 350 นาโนเมตร) ของ Tau441 LLPS (0–15 µM) ในกรณีที่ไม่มี (ซ้าย) หรือมี (ขวา) 50 µM αSสีโทนอุ่นบ่งบอกถึงการกระเจิงที่มากขึ้นd การกระเจิงของแสงของตัวอย่าง αS / Tau441 LLPS ด้วยการเพิ่มความเข้มข้น α S (Tau441 ที่ 5 µM, N = การทำซ้ำตัวอย่าง 2–3 ครั้งตามที่ระบุ)e แผนผังของตัวแปรเทาว์โปรตีนบางชนิดและบริเวณต่างๆ ของโปรตีนที่ใช้ในการศึกษานี้: โดเมนปลาย N ที่มีประจุลบ (สีแดง) บริเวณที่อุดมด้วยโพรลีน (สีน้ำเงิน) โดเมนการจับไมโครทูบูล (MTBD เน้นด้วยสีส้ม) และ เกลียวคู่ที่ก่อตัวเป็นอะไมลอยด์บริเวณเส้นใย (PHF) ที่อยู่ภายใน MTBD (สีเทา)แผนที่ค่าใช้จ่ายสุทธิต่อสารตกค้าง (NCPR) ของ Tau441 จะปรากฏขึ้นf ใช้ 1 µM AF488 ที่มีป้ายกำกับ αS และ Atto647N ที่มีป้ายกำกับ ΔNt- โดยใช้ 1 µM AF488 ที่มีป้ายกำกับ αS หรือ ΔCt-αS ต่อหน้า ΔNt-Tau (ด้านบน, 10 µM ต่อโปรตีน) หรือ K18 (ด้านล่าง, 50 µM ต่อโปรตีน ) ) ) ภาพไมโครกราฟของ WF ที่ควบแน่นในบัฟเฟอร์ LLPS หรือ K18แถบมาตราส่วนในภาพเดียวแสดงถึงขนาดของภาพทั้งหมดในแผงเดียว (20 µm สำหรับแผง a, b และ f)ข้อมูลดิบสำหรับพาเนล c และ d จัดทำเป็นไฟล์ข้อมูลดิบ
เพื่อทดสอบบทบาทของ α S ในกระบวนการ LLPS นี้ ก่อนอื่นเราได้ตรวจสอบผลกระทบของ α S ต่อความเสถียรของหยดโดย nephelometry โดยใช้ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ NaCl (รูปที่ 2c)ยิ่งความเข้มข้นของเกลือในตัวอย่างที่ประกอบด้วย αS สูง ค่าการกระเจิงของแสงก็จะยิ่งสูงขึ้น (ที่ 350 นาโนเมตร) ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทการรักษาเสถียรภาพของ αS ในระบบ LLPS นี้ผลที่คล้ายกันสามารถสังเกตได้โดยการเพิ่มความเข้มข้น αS (และด้วยเหตุนี้อัตราส่วน αS:Tau441) ถึงประมาณเพิ่มขึ้น 10 เท่าเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของเทา (5 µM) (รูปที่ 2d)เพื่อแสดงให้เห็นว่า α S เป็นโปรตีนนั่งร้านใน coacervates เราตัดสินใจตรวจสอบพฤติกรรมของ Tau กลายพันธุ์ที่ถูกรบกวน LLPS ซึ่งขาดบริเวณ N-terminal ที่มีประจุลบ (สารตกค้าง 1–150 ดูรูปที่ 2e) เรียกว่า ΔNt-Tauกล้องจุลทรรศน์ WF และ nephelometry ยืนยันว่า ΔNt-Tau เองไม่ได้รับ LLPS (รูปที่ 2f และรูปที่ 2 เพิ่มเติม) ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ 14 อย่างไรก็ตาม เมื่อเพิ่ม α S ลงในโซลูชันการกระจายตัวของตัวแปร Tau ที่ถูกตัดทอนนี้ กระบวนการ LLPS ก็เสร็จสมบูรณ์ คืนสภาพด้วยความหนาแน่นของหยดใกล้กับความหนาแน่นของหยดของสารละลายขนาดเต็มของ Tau และ αS ภายใต้สภาวะและความเข้มข้นของโปรตีนที่คล้ายคลึงกันกระบวนการนี้สามารถสังเกตได้ภายใต้เงื่อนไขของการอัดแน่นของโมเลกุลขนาดใหญ่ต่ำ (รูปที่ 2c เพิ่มเติม)บทบาทของภูมิภาค C-terminal αS แต่ไม่ใช่ความยาวทั้งหมดในกระบวนการ LLPS แสดงให้เห็นโดยการยับยั้งการก่อตัวของหยดโดยใช้ตัวแปร αS ที่ถูกตัดทอนของ C-terminal ซึ่งขาดสารตกค้าง 104–140 (รูปที่ 1a) ของ (ΔCt- αS) โปรตีน (รูปที่ 2f และรูปที่ 2d เสริม)การรวมตัวกันของ α S และ ΔNt-Tau ได้รับการยืนยันโดยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบคอนโฟคอล (รูปที่ 1b เพิ่มเติม)
เพื่อทดสอบกลไก LLPS เพิ่มเติมระหว่าง Tau441 และ αS มีการใช้ตัวแปร Tau เพิ่มเติม กล่าวคือชิ้นส่วนแกนเส้นใยเกลียว (PHF) ที่จับคู่ในโดเมนการจับกับไมโครทูบูล (MTBD) ซึ่งถ้ามันมีโดเมนการทำซ้ำที่มีลักษณะเฉพาะสี่โดเมน หรือที่รู้จักกันทั่วไป เป็นชิ้นส่วน K18 (ดูรูปที่ 2e)มีรายงานเมื่อเร็วๆ นี้ว่า αS จับกับโปรตีนเทาที่อยู่ในโดเมนที่อุดมด้วยโพรลีนเป็นพิเศษในลำดับที่นำหน้าโดเมนที่มีผลผูกพันกับไมโครทูบูลอย่างไรก็ตาม บริเวณ PHF ยังอุดมไปด้วยสารตกค้างที่มีประจุบวก (ดูรูปที่ 2e) โดยเฉพาะไลซีน (สารตกค้าง 15%) ซึ่งกระตุ้นให้เราทดสอบว่าบริเวณนี้มีส่วนช่วยในการควบแน่นของคอมเพล็กซ์ αS/Tau หรือไม่เราสังเกตว่า K18 เพียงอย่างเดียวไม่สามารถกระตุ้น LLPS ที่ความเข้มข้นสูงถึง 100 μM ภายใต้เงื่อนไขที่ทดสอบ (บัฟเฟอร์ LLPS ที่มี PEG 15% หรือเดกซ์แทรน 20%) (รูปที่ 2f)อย่างไรก็ตามเมื่อเราเพิ่ม 50 µM αS ถึง 50 µM K18 การก่อตัวอย่างรวดเร็วของหยดโปรตีนที่มี K18 และ αS ถูกสังเกตโดย nephelometry (รูปที่ 2 เพิ่มเติม) และกล้องจุลทรรศน์ WF (รูปที่ 2f)ตามที่คาดไว้ ΔCt-αS ไม่สามารถคืนค่าพฤติกรรม LLPS ของ K18 (รูปที่ 2f)เราสังเกตว่าการรวมตัวของ αS/K18 ต้องการความเข้มข้นของโปรตีนที่สูงขึ้นเล็กน้อยเพื่อกระตุ้น LLPS เมื่อเปรียบเทียบกับ αS/ΔNt-Tau หรือ αS/Tau441 สิ่งอื่นๆ ที่เท่าเทียมกันสิ่งนี้สอดคล้องกับปฏิสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งของภูมิภาค αS C-terminal กับโดเมน Tau ที่อุดมด้วยโพรลีน เมื่อเปรียบเทียบกับโดเมนที่มีผลผูกพันกับ microtubule ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า 31
เนื่องจาก ΔNt-Tau ไม่สามารถดำเนินการ LLPS ได้ในกรณีที่ไม่มี αS เราจึงเลือกตัวแปร Tau นี้เป็นแบบจำลองสำหรับการกำหนดลักษณะ αS / Tau LLPS เนื่องจากความเรียบง่ายในระบบ LLPS ที่มี Tau ความยาวเต็ม (isotype, Tau441 / Tau441)ด้วยกระบวนการรวมกลุ่มที่ซับซ้อน (เฮเทอโรไทป์, αS/Tau441)เราเปรียบเทียบระดับของการรวม αS (ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของโปรตีนเฟสควบแน่น, fαS, c) ในระบบ αS / Tau และ αS / ΔNt-Tau โดยการปั่นแยกและการวิเคราะห์ SDS-PAGE เฟสแยกย้ายกัน (ดู 2e) พบค่าที่คล้ายกันมาก สำหรับโปรตีนทุกชนิดที่มีความเข้มข้นเท่ากันโดยเฉพาะอย่างยิ่งเราได้รับ fαS,c 84 ± 2% และ 79 ± 7% สำหรับ αS/Tau และ αS/ΔNt-Tau ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าปฏิสัมพันธ์แบบเฮเทอโรไทป์ระหว่าง αS และ tau นั้นเหนือกว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลเอกภาพระหว่าง.
อันตรกิริยากับโพลิแคตชันต่างๆ และผลของกระบวนการควบแน่นต่อจลนพลศาสตร์ของ αS ได้รับการศึกษาครั้งแรกโดยวิธีการกู้คืนฟลูออเรสเซนซ์หลังจากการฟอกด้วยแสง (FRAP)เราทดสอบ coacervates αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau และ αS / pLK (100 μM αS เสริมด้วย 2 μM αS AF488-αS และ 100 μM Tau441 หรือ ΔNt-Tau หรือ 1 mM pLK)ได้รับข้อมูลภายใน 30 นาทีแรกหลังจากผสมส่วนประกอบของตัวอย่างจากรูปภาพ FRAP ที่เป็นตัวแทน (รูปที่ 3a, การควบแน่นของ αS / Tau441) และเส้นโค้งเวลาที่สอดคล้องกัน (รูปที่ 3b, รูปที่ 3 เพิ่มเติม) จะเห็นได้ว่าจลนพลศาสตร์ของ αS นั้นคล้ายคลึงกับของ Tau441 coacervates มากและ ΔNt-Tau ซึ่งเร็วกว่ามากเมื่อใช้ pLKค่าสัมประสิทธิ์การแพร่กระจายที่คำนวณได้สำหรับ αS ภายใน coacervate ตาม FRAP (ตามที่อธิบายโดย Kang และคณะ 35) คือ D = 0.013 ± 0.009 µm2/s และ D = 0.026 ± 0.008 µm2/s สำหรับ αS/Tau441 และ αS/ΔNt- สำหรับ ระบบ αS/pLK, Tau และ D = 0.18 ± 0.04 µm2/s ตามลำดับ (รูปที่ 3c)อย่างไรก็ตาม ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่ αS ในเฟสการกระจายตัวนั้นมีขนาดหลายคำสั่งที่สูงกว่าเฟสควบแน่นทั้งหมด ตามที่กำหนดโดย Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS ดูรูปที่ 3 เพิ่มเติม) ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน (บัฟเฟอร์ LLPS) แต่ในกรณีที่ไม่มี polycations (D = 8 ± 4 µm2/วินาที)ดังนั้น จลนพลศาสตร์ของการแปล αS จะลดลงอย่างมีนัยสำคัญใน coacervates เมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนในระยะที่กระจายตัวเนื่องจากผลกระทบจากการรวมตัวของโมเลกุลที่เด่นชัด แม้ว่า coacervates ทั้งหมดจะรักษาคุณสมบัติคล้ายของเหลวในช่วงครึ่งชั่วโมงแรกหลังจากการก่อตัว ตรงกันข้ามกับเฟสเทาจลนพลศาสตร์เร็วขึ้นในคอนเดนเสท pLK
การวิเคราะห์ a – c FRAP ของไดนามิกของαS (2% ที่มีป้ายกำกับ AF488 αS) ใน coacervates ไฟฟ้าสถิตรูปภาพตัวแทนของการทดสอบ αS/Tau441 FRAP เป็นสามเท่าจะแสดงใน (a) โดยที่วงกลมสีแดงบ่งบอกถึงพื้นที่ที่ถูกลดสีสเกลบาร์คือ 5 µmb เส้นโค้ง FRAP เฉลี่ยและ ( c ) ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่กระจายที่คำนวณได้ ( D ) สำหรับหยดที่แตกต่างกัน 5–6 ( N ) จากการทดลองสามครั้งโดยใช้ 100 µM α S และความเข้มข้นที่เท่ากันของ Tau441 (สีแดง) หรือ ΔNt-Tau (สีน้ำเงิน) หรือ pLK (สีเขียว) ที่ความเข้มข้นสิบเท่าของ LLPSค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของเส้นโค้ง FRAP จะแสดงเป็นสีแรเงาสำหรับการเปรียบเทียบ ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่กระจาย α S ในเฟสการกระจายถูกกำหนดเป็นสามเท่าโดยใช้สเปกโทรสโกปีสหสัมพันธ์เรืองแสง (FCS) (ดูรูปที่ 3 เพิ่มเติมและวิธีการสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม)d สเปกตรัม EPR X-band ต่อเนื่องที่ 100 μM TEMPOL-122-αS ในบัฟเฟอร์ LLPS โดยไม่มี polycation ใด ๆ (สีดำ) หรือต่อหน้า 100 μM Tau441 (สีแดง) หรือ ΔNt-Tau (สีน้ำเงิน) หรือ 1 mM pLK (สีเขียว)สิ่งที่ใส่เข้าไปแสดงมุมมองแบบขยายของเส้นสนามที่แข็งแกร่งซึ่งเกิดการเปลี่ยนแปลงครั้งใหญ่ที่สุดe เส้นโค้งการเชื่อมโยง 50 μM TEMPOL-122-αS พร้อมโพลีแคตต่างๆ ในกรณีที่ไม่มี LLPS (ไม่มี PEG)แอมพลิจูดที่ลดลงของแบนด์ III เมื่อเปรียบเทียบกับแบนด์ II (IIII/III) ของสเปกตรัม EPR ที่ทำให้เป็นมาตรฐานจะแสดงเพื่อเพิ่มอัตราส่วนฟันกรามของ Tau441 (สีแดง), ΔNt-Tau (สีน้ำเงิน) และ pLK (สีเขียว)เส้นสีแสดงความเหมาะสมกับข้อมูลโดยใช้แบบจำลองการเชื่อมโยงแบบคร่าวๆ โดยมีตำแหน่งการเชื่อมโยงที่เหมือนกันและเป็นอิสระในแต่ละเส้นโค้งข้อมูลดิบจะถูกจัดเตรียมไว้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลดิบ
เพื่อเป็นส่วนเสริม เราได้ตรวจสอบไดนามิกของ αS ใน coacervates ต่างๆ โดยใช้การติดฉลากสปินโดยตรง (SDSL) และการเรโซแนนซ์พาราแมกเนติกอิเล็กตรอนแบบต่อเนื่อง (CW-EPR)วิธีการนี้ได้พิสูจน์แล้วว่ามีประโยชน์มากในการรายงานความยืดหยุ่นและไดนามิกของ IDP ด้วยความละเอียดคงเหลือที่สมจริง36,37,38ด้วยเหตุนี้ เราจึงสร้างซีสเตอีนที่ตกค้างใน Cys กลายพันธุ์เดี่ยว และใช้โพรบหมุน 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL)อนุพันธ์ของมาเลอิไมด์ติดฉลากไว้โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราใส่โพรบ TEMPOL ที่ตำแหน่ง 122 หรือ 24 αS (TEMPOL-122-αS และ TEMPOL-24-αS)ในกรณีแรก เรากำหนดเป้าหมายไปที่บริเวณปลาย C ของโปรตีน ซึ่งเกี่ยวข้องกับการโต้ตอบกับโพลีแคตชันตำแหน่งที่ 24 จะให้ข้อมูลเกี่ยวกับไดนามิกโดยรวมของโปรตีนในคอนเดนเสทแทนในทั้งสองกรณี สัญญาณ EPR ที่ได้รับสำหรับโปรตีนของระยะที่กระจายจะสอดคล้องกับอนุมูลไนตรอกไซด์ในสถานะเคลื่อนที่เร็วหลังจากการแยกเฟสโดยมีเทาหรือ pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 หรือ ΔNt-Tau ในอัตราส่วน 1:1 หรือ pLK ที่อัตราส่วน 1:10) การเพิ่มขึ้นของความเข้มสูงสุดสัมพัทธ์ถูกสังเกตใน สเปกตรัม EPR ของ αSเส้นการสูญเสียกว้างขึ้น ซึ่งบ่งชี้จลนศาสตร์การปรับทิศทางของαSที่ลดลงในหยดเมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนในระยะเจือจาง (รูปที่ 3 มิติ, รูปที่ 4a เพิ่มเติม)การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้จะเด่นชัดมากขึ้นที่ตำแหน่ง 122 ในขณะที่ตำแหน่ง 24 การมีอยู่ของ pLK ไม่ส่งผลกระทบต่อจลนพลศาสตร์ของโพรบ ที่ตำแหน่ง 122 รูปร่างเส้นสเปกตรัมเปลี่ยนไปอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4a เพิ่มเติม)เมื่อเราพยายามสร้างแบบจำลองสเปกตรัมที่ตำแหน่ง 122 ของระบบ αS / polycation สองตัวโดยใช้แบบจำลองไอโซโทรปิก (รูปที่ 5a เพิ่มเติม) ที่ใช้กันทั่วไปเพื่ออธิบายพลวัตของ IDP38, 39 ที่มีป้ายกำกับการหมุน เราไม่สามารถสร้างสเปกตรัมทดลองขึ้นมาใหม่ได้.การจำลองสเปกตรัมของตำแหน่งของคอนทราสต์ 24 สปิน (รูปที่ 5a เพิ่มเติม)สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่ามีตำแหน่งพิเศษในพื้นที่ของการกำหนดค่าการหมุนของขอบเขต C-terminal ของ αS ต่อหน้า polycationsเมื่อพิจารณาเศษส่วนของ αS ในเฟสควบแน่นภายใต้เงื่อนไข EPR ทดลอง (84 ± 2%, 79 ± 7% และ 47 ± 4% สำหรับ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau และ αS/pLK ตามลำดับ - ดูเพิ่มเติม รูปที่ 2e ของการวิเคราะห์ข้อมูล c) จะเห็นได้ว่าการขยายที่ตรวจพบโดยวิธี EPR ส่วนใหญ่สะท้อนถึงปฏิสัมพันธ์ของบริเวณปลาย C ของ αS กับโพลิแคตชันต่างๆ ในเฟสควบแน่น (การเปลี่ยนแปลงหลักเมื่อใช้ TEMPOL-122- αS) และไม่ใช่การควบแน่นของโปรตีนพบว่ามีความหนืดเพิ่มขึ้นในโพรบตามที่คาดไว้ สเปกตรัม EPR ของโปรตีนภายใต้เงื่อนไขอื่นที่ไม่ใช่ LLPS จะได้รับการฟื้นฟูอย่างสมบูรณ์เมื่อเติม NaCl 1 M ลงในส่วนผสม (รูปที่ 4b เพิ่มเติม)โดยรวมแล้วข้อมูลของเราแนะนำว่าการเปลี่ยนแปลงที่ตรวจพบโดย CW-EPR ส่วนใหญ่สะท้อนถึงปฏิสัมพันธ์ของภูมิภาค C-terminal ของ αS กับ polycations ต่างๆ ในเฟสควบแน่น และปฏิสัมพันธ์นี้ดูเหมือนจะแข็งแกร่งกว่ากับ pLK มากกว่ากับ Tau
เพื่อให้ได้ข้อมูลเชิงโครงสร้างเพิ่มเติมเกี่ยวกับโปรตีนในโคเซอร์เวต เราจึงตัดสินใจศึกษาระบบ LLPS โดยใช้ NMR ในสารละลายอย่างไรก็ตาม เราสามารถตรวจจับได้เฉพาะเศษส่วน αS ที่เหลืออยู่ในระยะกระจายตัว ซึ่งอาจเนื่องมาจากการเปลี่ยนแปลงของโปรตีนที่ลดลงภายในโคเซอร์เวตและระยะหนาแน่นที่ด้านล่างของสารละลายในการวิเคราะห์ NMRเมื่อเราวิเคราะห์โครงสร้างและพลวัตของโปรตีนที่เหลืออยู่ในระยะกระจายของตัวอย่าง LLPS โดยใช้ NMR (รูปที่ 5c เสริม, d) เราสังเกตเห็นว่าโปรตีนนั้นมีพฤติกรรมเกือบจะเหมือนกันเมื่อมี pLK และ ΔNt-Tau ทั้งสองอย่าง ซึ่งอยู่ในโครงสร้างทุติยภูมิและไดนามิกของกระดูกสันหลังของโปรตีน ซึ่งเปิดเผยโดยการทดลองเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงทางเคมีทุติยภูมิและการผ่อนคลายของ R1ρข้อมูล NMR แสดงให้เห็นว่าปลาย C ของ αS ทนทุกข์ทรมานกับการสูญเสียความยืดหยุ่นเชิงโครงสร้างอย่างมีนัยสำคัญในขณะที่ยังคงรักษาธรรมชาติที่ไม่เป็นระเบียบ เช่นเดียวกับส่วนที่เหลือของลำดับโปรตีน เนื่องจากอันตรกิริยาของมันกับโพลีแคตไอออน
เนื่องจากการขยายสัญญาณ CW-EPR ที่สังเกตได้ในเฟสควบแน่น TEMPOL-122-αS สะท้อนถึงอันตรกิริยาของโปรตีนกับโพลีแคตชัน เราจึงทำการไตเตรท EPR เพื่อประเมินความสัมพันธ์การจับกันของ αS กับโพลีแคตต่างๆ ในกรณีที่ไม่มี LLPS (ไม่มีการสะสมของ บัฟเฟอร์ LLPS) แนะนำว่าปฏิสัมพันธ์จะเหมือนกันในระยะเจือจางและเข้มข้น (ซึ่งได้รับการยืนยันจากข้อมูลของเรา รูปที่ 4a เพิ่มเติม และรูปที่ 6 เพิ่มเติม)เป้าหมายคือการดูว่า coacervates ทั้งหมด แม้จะมีคุณสมบัติคล้ายของเหลวทั่วไปหรือไม่ แสดงพฤติกรรมที่แตกต่างที่ซ่อนอยู่ในระดับโมเลกุลหรือไม่ตามที่คาดไว้ สเปกตรัม EPR ขยายกว้างขึ้นเมื่อความเข้มข้นของ polycation เพิ่มขึ้น ซึ่งสะท้อนถึงความยืดหยุ่นของโมเลกุลที่ลดลงเนื่องจากปฏิสัมพันธ์ของโมเลกุลของพันธมิตรที่มีปฏิสัมพันธ์ทั้งหมดเกือบจะอิ่มตัว (รูปที่ 3e, รูปที่ 6 เพิ่มเติม)pLK บรรลุความอิ่มตัวนี้ที่อัตราส่วนฟันกรามต่ำกว่า (polycation: α S) เมื่อเปรียบเทียบกับ ΔNt-Tau และ Tau441ในความเป็นจริง การเปรียบเทียบข้อมูลกับแบบจำลองการจับโดยประมาณโดยสมมติว่าไม่มีตำแหน่งการจับที่เหมือนกันและเป็นอิสระ แสดงให้เห็นว่าค่าคงที่การแยกตัวที่ชัดเจนของ pLK (~5 μM) เป็นลำดับความสำคัญต่ำกว่าของ Tau441 หรือ ΔNt-Tau (~50 μM) ).ไมโครโมลาร์)แม้ว่านี่จะเป็นการประมาณการคร่าวๆ แต่สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า αS มีสัมพรรคภาพสูงกว่าสำหรับโพลิแคตไอออนที่เรียบง่ายกว่าซึ่งมีบริเวณประจุบวกต่อเนื่องเมื่อพิจารณาถึงความแตกต่างในความสัมพันธ์ระหว่าง αS และโพลีแคตต่างๆ เราตั้งสมมติฐานว่าคุณสมบัติของของเหลวอาจเปลี่ยนแปลงแตกต่างกันไปเมื่อเวลาผ่านไป และด้วยเหตุนี้จึงต้องทนทุกข์ทรมานจากกระบวนการ LSPT ที่แตกต่างกัน
เมื่อพิจารณาจากสภาพแวดล้อมที่มีผู้คนหนาแน่นมากภายในโปรตีน coacervate และธรรมชาติของอะไมลอยด์ของโปรตีน เราสังเกตพฤติกรรมของ coacervate เมื่อเวลาผ่านไปเพื่อตรวจจับกระบวนการ LSPT ที่เป็นไปได้ด้วยการใช้กล้องจุลทรรศน์ BF และ CF (รูปที่ 4) เราสังเกตว่า αS / Tau441 coacervates ในสารละลายขนาดใหญ่ ก่อตัวเป็นหยดขนาดใหญ่ที่สัมผัสและทำให้พื้นผิวเปียกที่ด้านล่างของหลุม / สไลด์เป็นหยดเต็มตามที่คาดไว้ (รูปที่ 4 เพิ่มเติม) . 7วัน);เราเรียกโครงสร้างที่อยู่ด้านล่างเหล่านี้ว่า "แพโปรตีน"โครงสร้างเหล่านี้ยังคงสภาพคล่องเนื่องจากยังคงความสามารถในการหลอมรวม (รูปที่ 7b เสริม) และสามารถมองเห็นได้เป็นเวลาหลายชั่วโมงหลังจาก LLPS ถูกกระตุ้น (รูปที่ 4 และรูปที่ 7c เพิ่มเติม)เราสังเกตว่ากระบวนการทำให้เปียกได้รับการสนับสนุนบนพื้นผิวของที่ชอบน้ำมากกว่าวัสดุที่ไม่ชอบน้ำ (รูปที่ 7a เสริม) ตามที่คาดไว้สำหรับ coacervates ไฟฟ้าสถิตที่มีประจุไม่สมดุลและทำให้พื้นผิวมีไฟฟ้าสถิตสูงโดยเฉพาะอย่างยิ่ง การรวมตัวกันและการล่องแพของ αS/ΔNt-Tau ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่คอนเดนเสท αS/pLK ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4)ในช่วงเวลาฟักตัวอันสั้น หยด αS/pLK สามารถรวมตัวกันและทำให้พื้นผิวที่ชอบน้ำเปียกได้ แต่กระบวนการนี้หยุดลงอย่างรวดเร็วและหลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 5 ชั่วโมง มีเพียงเหตุการณ์การรวมตัวกันที่จำกัดเท่านั้นและไม่มีการเปียกเลย– การเปลี่ยนผ่านของเจลหยด
ตัวแทน BF (แผงระดับสีเทา) และ CF (แผงด้านขวา, AF488 ที่มีป้ายกำกับ αS เป็นสีเขียว) ของตัวอย่าง coacervate ที่มี 100 µM αS (ฉลากฟลูออเรสเซนต์ 1%) ในบัฟเฟอร์ LLPS ต่อหน้า 100 µM Tau441 (บนสุด) ภาพเรืองแสง) ภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ ΔNt -เทา (ตรงกลาง) หรือ 1 mM pLK (ด้านล่าง) ที่เวลาฟักตัวและความสูงโฟกัสต่างกัน (z, ระยะห่างจากด้านล่างของหลุมแผ่น)การทดลองซ้ำ 4-6 ครั้งโดยแยกจากกันโดยให้ผลลัพธ์เดียวกันโคเซอร์เวต αS/Tau441 จะถูกทำให้เปียกหลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง ทำให้เกิดแพที่มีขนาดใหญ่กว่าภาพแถบมาตราส่วนสำหรับภาพทั้งหมดคือ 20 µm
จากนั้นเราถามว่าแอ่งโปรตีนที่มีลักษณะคล้ายของเหลวขนาดใหญ่ที่เกิดขึ้นใน αS/Tau441 LLPS จะนำไปสู่การรวมตัวของอะไมลอยด์ของโปรตีนใดๆ ที่ศึกษาหรือไม่เราติดตามการเจริญเติบโตของหยด αS / Tau441 เมื่อเวลาผ่านไปด้วยกล้องจุลทรรศน์ WF ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับข้างต้น แต่ใช้ 1 μM AF488 ที่มีป้ายกำกับ αS และ Tau441 ที่มีป้ายกำกับ Atto647N (รูปที่ 5a)ตามที่คาดไว้ เราสังเกตการแปลโปรตีนโดยสมบูรณ์ตลอดกระบวนการสุกที่น่าสนใจคือตั้งแต่ประมาณปี ค.ศ.หลังจากผ่านไป 5 ชั่วโมง จะสังเกตเห็นโครงสร้างที่ไม่ใช่วงกลมที่มีความเข้มข้นมากขึ้นภายในแพ ซึ่งเราเรียกว่า "จุด" ซึ่งบางส่วนถูกจัดกลุ่มด้วย αS และบางส่วนได้รับการเสริมสมรรถนะใน Tau441 (รูปที่ 5a ลูกศรสีขาว)จุดเหล่านี้มักถูกสังเกตภายในแพเสมอในระดับที่สูงกว่าสำหรับ αS/ΔNt-Tau มากกว่าสำหรับ αS/ΔNt-Tauไม่มีจุดที่ชัดเจนในหยดของระบบ pLK และ Tau ที่ไม่สามารถหลอมรวม/ทำให้เปียกได้เพื่อทดสอบว่าคราบเหล่านี้ที่มี αS และ Tau441 เป็นกลุ่มรวมคล้ายอะไมลอยด์หรือไม่ เราทำการทดลองที่คล้ายกันโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ CF โดยที่ Tau441 ติดป้ายกำกับด้วย Atto647N และเติมไทโอฟลาวิน-T (ThT) เฉพาะอะไมลอยด์ 12.5 μM ตั้งแต่เริ่มต้นย้อม.แม้ว่าการย้อมสี ThT ของหยดαS / Tau441 หรือแพจะไม่ถูกสังเกตแม้หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง (รูปที่ 5b แถวบนสุด - หยดที่เหลืออยู่เหนือแพโปรตีน) โครงสร้างเชิงบวกของ ThT ที่มี Atto647N-Tau441 ภายในแพนั้นอ่อนแอมากสิ่งนี้จำลองขนาด รูปร่าง และตำแหน่งของจุดที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (รูปที่ 5b แถวกลางและล่าง) โดยบอกว่าจุดนั้นอาจสอดคล้องกับมวลรวมคล้ายอะไมลอยด์ที่เกิดขึ้นใน coacervates ของไหลที่มีอายุมากขึ้น
WF 25 μM αS ที่เวลาฟักตัวและความสูงโฟกัสต่างๆ (z, ระยะทางจากด้านล่างที่ไม่ได้ผูกไว้) ต่อหน้า 25 μM Tau441 (1 μM AF488 ที่มีป้ายกำกับ αS และ Atto647N ที่มีป้ายกำกับ Tau441) ในหลุมของแผ่นกล้องจุลทรรศน์ที่มีบัฟเฟอร์ LLPS) .การทดลองหกครั้งทำซ้ำอย่างอิสระโดยให้ผลลัพธ์ที่คล้ายกันb ภาพกล้องจุลทรรศน์ CF ที่ 25 μM αS ต่อหน้า 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N ที่มีป้ายกำกับ Tau441) และ 12.5 μM thoflavin-T (ThT)หยดโปรตีนถ่วงน้ำหนักและแพโปรตีนและสปอตที่สะสมจะแสดงในแถวบนและตรงกลางตามลำดับแถวล่างแสดงภาพแพและหยดจาก 3 ลำจำลองที่แยกจากกันลูกศรสีขาวหมายถึงจุดบวก ThT ในทั้งสองแผงแถบมาตราส่วนสำหรับภาพทั้งหมดคือ 20 µm
เพื่อตรวจสอบรายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงในเครือข่ายโปรตีน coacervate ในระหว่างการเปลี่ยนจากของเหลวเป็นของแข็ง เราใช้การถ่ายภาพอายุการใช้งานเรืองแสง (FLIM) และกล้องจุลทรรศน์การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์Förster (FRET) (รูปที่ 6 และรูปที่ 8 และ 9 เพิ่มเติม)เราตั้งสมมติฐานว่าการสุกของชั้น coacervate ในโครงสร้างโปรตีนรวมที่ควบแน่นมากขึ้นหรือแม้กระทั่งของแข็งที่นำไปสู่การสัมผัสที่ใกล้ชิดยิ่งขึ้นระหว่างโปรตีนและโพรบฟลูออเรสเซนต์ที่ติดอยู่กับมัน อาจทำให้เกิดผลการดับที่แสดงในอายุการใช้งานของโพรบที่สั้นลง ( τ ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้40,41 ,42.นอกจากนี้ สำหรับตัวอย่างที่มีป้ายกำกับคู่ (AF488 และ Atto647N ในฐานะสีย้อมของผู้บริจาคและตัวรับ FRET ตามลำดับ) การลดลงของ τ นี้ยังสามารถมาพร้อมกับการควบแน่น coacervate และการเพิ่มประสิทธิภาพ FRET(E) ในระหว่าง LSPTเราติดตามการก่อตัวแพและจุดตลอดเวลาในตัวอย่าง LLPS αS/Tau441 และ αS/ΔNt-Tau (25 µM ของโปรตีนแต่ละตัวในบัฟเฟอร์ LLPS ที่ประกอบด้วย 1 µM AF488 ที่มีป้ายกำกับ αS และ/หรือ Atto647N ที่มีป้ายกำกับ Tau441 หรือ ΔNt-Tau)เราสังเกตแนวโน้มทั่วไปว่าอายุการเรืองแสงของโพรบ AF488 (τ488) และ Atto647N (τ647N) ลดลงเล็กน้อยเมื่อ coacervates ครบกำหนด (รูปที่ 6 และรูปที่ 8c เพิ่มเติม)สิ่งที่น่าสนใจคือการเปลี่ยนแปลงนี้ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญสำหรับจุดภายในแพ (รูปที่ 6c) ซึ่งบ่งชี้ว่าเกิดการควบแน่นของโปรตีนเพิ่มเติมที่จุดต่างๆเพื่อสนับสนุนสิ่งนี้ ไม่พบการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในอายุการใช้งานของฟลูออเรสเซนซ์สำหรับหยด αS / ΔNt-Tau ที่มีอายุ 24 ชั่วโมง (รูปที่ 8 เพิ่มเติม) ซึ่งบ่งชี้ว่าการเกิดเจลของหยดเป็นกระบวนการที่แตกต่างจากการจำ และไม่ได้มาพร้อมกับการปรับโครงสร้างโมเลกุลที่มีนัยสำคัญ ภายใน coacervatesควรสังเกตว่าจุดมีขนาดแตกต่างกันและเนื้อหาที่แปรผันใน α S โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับระบบ α S / Tau441 (รูปที่ 8 เพิ่มเติม)อายุการใช้งานสปอตฟลูออเรสเซนต์ที่ลดลงนั้นมาพร้อมกับความเข้มที่เพิ่มขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ Atto647N ที่มีป้ายกำกับ Tau441 (รูปที่ 8a เสริม) และประสิทธิภาพ FRET ที่สูงขึ้นสำหรับทั้งระบบ αS / Tau441 และ αS / ΔNt-Tau ซึ่งบ่งบอกถึงการควบแน่นเพิ่มเติมใน LLPS ห้าชั่วโมง หลังจากกระตุ้น โปรตีนภายในไฟฟ้าสถิตจะควบแน่นเมื่อเปรียบเทียบกับαS / ΔNt-Tau เราสังเกตเห็นค่า τ647N ที่ต่ำกว่าและค่า τ488 ค่อนข้างสูงกว่าในจุด αS / Tau441 พร้อมด้วยค่า FRET ที่ต่ำกว่าและไม่เป็นเนื้อเดียวกันมากขึ้นอาจเป็นไปได้ว่านี่อาจเกี่ยวข้องกับความจริงที่ว่าในระบบ αS / Tau441 ความอุดมสมบูรณ์ของ αS ที่สังเกตและคาดหวังในมวลรวมนั้นมีความหลากหลายมากกว่า ซึ่งมักจะเป็น substoichiometric เมื่อเปรียบเทียบกับ Tau เนื่องจาก Tau441 เองก็อาจได้รับ LLPS และการรวมตัวด้วย (รูปที่ 8 เพิ่มเติม) .อย่างไรก็ตาม ระดับของการรวมตัวกันของหยด การก่อตัวของแพ และที่สำคัญ การรวมตัวของโปรตีนภายใน coacervates ที่มีลักษณะคล้ายของเหลวนั้นมีค่าสูงสุดเมื่อมีทั้ง Tau441 และ αS
ภาพกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ตลอดชีวิต (FLIM) ของ αS / Tau441 และ αS / ΔNt-Tau ที่ 25 μM ของโปรตีนแต่ละชนิด (1 μM AF488 ที่มีป้ายกำกับ αS และ 1 μM Atto647N ที่มีป้ายกำกับ Tau441 หรือ ΔNt-Tau) ในบัฟเฟอร์ LLPSคอลัมน์แสดงรูปภาพที่เป็นตัวแทนของตัวอย่าง LLPS ที่เวลาการทำให้สุกที่แตกต่างกัน (30 นาที, 5 ชั่วโมง และ 24 ชั่วโมง)กรอบสีแดงแสดงบริเวณที่มีจุด αS/Tau441ช่วงชีวิตจะแสดงเป็นแถบสีแถบมาตราส่วน = 20 µm สำหรับรูปภาพทั้งหมดb ภาพ FLIM ที่ซูมเข้าของพื้นที่ที่เลือก ซึ่งแสดงในกล่องสีแดงในแผง aช่วงชีวิตจะแสดงโดยใช้ระดับสีเดียวกับในแผง aสเกลบาร์ = 5 µmc ฮิสโตแกรมแสดง AF488 (ติดกับ α S) หรือ Atto647N (ติดกับ Tau) สำหรับโปรตีนสายพันธุ์ต่าง ๆ (หยด -D-, แพ -R- และ speckle-P) ที่ระบุในภาพ FLIM ที่บันทึกสำหรับ αS-) การกระจายเวลา อายุการใช้งานของ Tau441 และ ตัวอย่าง coacervate αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI สำหรับ D, 29-44 ROI สำหรับ R และ 21-51 ROI สำหรับคะแนน)ค่าเฉลี่ยและค่ามัธยฐานจะแสดงเป็นสี่เหลี่ยมสีเหลืองและเส้นสีดำภายในกล่องตามลำดับขอบเขตล่างและบนของกล่องแสดงถึงควอไทล์ที่หนึ่งและสามตามลำดับ และค่าต่ำสุดและสูงสุดภายในช่วงระหว่างควอไทล์ 1.5 เท่า (IQR) จะแสดงเป็นหนวดค่าผิดปกติจะแสดงเป็นเพชรสีดำนัยสำคัญทางสถิติระหว่างคู่ของการแจกแจงถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบทีสองตัวอย่าง โดยถือว่าความแปรปรวนไม่เท่ากันค่า p-test t-test แบบสองด้านจะแสดงด้วยเครื่องหมายดอกจันสำหรับข้อมูลเปรียบเทียบแต่ละคู่ (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns บ่งชี้ถึงความเล็กน้อย (p-value > 0.05)ค่า p ที่แน่นอนได้รับไว้ในตารางเสริม 1 และข้อมูลต้นฉบับจะแสดงเป็นไฟล์ข้อมูลดิบ
เพื่อแสดงให้เห็นเพิ่มเติมถึงลักษณะคล้ายอะไมลอยด์ของจุด/มวลรวม เราได้บำบัดตัวอย่างโคเซอร์เวตที่ไม่มีสีเป็นเวลา 24 ชั่วโมงด้วยความเข้มข้นสูงของ NaCl (1 โมลาร์) ซึ่งส่งผลให้มีการแยกมวลรวมออกจากโปรตีนโคเซอร์เวตเมื่อสังเกตมวลรวมที่แยกได้ (เช่น สารละลายที่กระจายตัวของมวลรวม) ถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม (AFM) เราสังเกตเห็นสัณฐานวิทยาทรงกลมส่วนใหญ่ที่มีความสูงปกติประมาณ 15 นาโนเมตร ซึ่งมีแนวโน้มที่จะเชื่อมโยงภายใต้สภาวะที่มีความเข้มข้นของเกลือสูง คล้ายกับ พฤติกรรมของไฟบริลอะไมลอยด์ทั่วไปเนื่องจากผลกระทบที่ไม่ชอบน้ำอย่างรุนแรงบนพื้นผิว (โปรดทราบว่าโดยทั่วไปแล้วไฟบริลจะมีความสูง ~ 10 นาโนเมตร) (รูปที่ 10a เพิ่มเติม)ที่น่าสนใจคือเมื่อมวลรวมที่แยกได้ถูกบ่มด้วย ThT ในการทดสอบฟลูออเรสเซนซ์ ThT มาตรฐาน เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมากของผลผลิตควอนตัมฟลูออเรสเซนต์ ThT ซึ่งเทียบได้กับที่สังเกตได้เมื่อสีย้อมถูกบ่มด้วย αS amyloid fibrils ทั่วไป (รูปที่ 10b เสริม) แนะนำว่า มวลรวม coacervate มีโครงสร้างคล้ายอะไมลอยด์.ในความเป็นจริงมวลรวมสามารถทนต่อความเข้มข้นของเกลือสูง แต่มีความไวต่อ 4 M guanidine คลอไรด์ (GdnHCl) เช่นเดียวกับไฟบริลอะไมลอยด์ทั่วไป (รูปที่ 10c เสริม)
ต่อไป เราวิเคราะห์องค์ประกอบของมวลรวมโดยใช้การเรืองแสงโมเลกุลเดี่ยว สหสัมพันธ์เรืองแสงจำเพาะ/สหสัมพันธ์ข้ามสเปกโทรสโกปี (FCS/FCCS) และการวิเคราะห์ต่อเนื่องของการตรวจจับความบังเอิญสองสี (TCCD)ด้วยเหตุนี้ เราจึงแยกมวลรวมที่เกิดขึ้นหลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในตัวอย่าง LLPS 100 μl ที่มี αS และ Tau441 (ทั้ง 25 μM) พร้อมด้วย 1 μM AF488 ที่มีป้ายกำกับ AF488 และ 1 μM Atto647N ที่มีป้ายกำกับ Tau441เจือสารละลายรวมที่กระจายตัวที่เป็นผลลัพธ์ไปเป็นสถานะโมเลกุลเดี่ยวโดยใช้บัฟเฟอร์ไร้ PEG เดียวกันและ NaCl 1 โมลาร์ (บัฟเฟอร์เดียวกันที่ใช้ในการแยกมวลรวมออกจากโคเซอร์เวต) เพื่อป้องกันอันตรกิริยาทางไฟฟ้าสถิตใดๆ ที่เป็นไปได้ระหว่าง LLPS และโปรตีนตัวอย่างของวิถีเวลาของโมเลกุลเดี่ยวสามารถดูได้ในรูปที่ 7aการวิเคราะห์ FCCS/FCS (ความสัมพันธ์ข้าม, CC และความสัมพันธ์อัตโนมัติ, AC) แสดงให้เห็นว่ามวลรวมที่มี αS และเทามีมากมายในตัวอย่าง (ดูเส้นโค้ง CC ในรูปที่ 7b แผงด้านซ้าย) และโปรตีนโมโนเมอริกที่เหลือส่วนเกินเกิดขึ้นเป็น ผลลัพธ์ของกระบวนการเจือจาง (ดูเส้นโค้ง AC ในรูปที่ 7b แผงด้านซ้าย)การทดลองควบคุมที่ดำเนินการภายใต้สภาวะของสารละลายเดียวกันโดยใช้ตัวอย่างที่มีเพียงโปรตีนโมโนเมอร์ไม่มีเส้นโค้ง CC และเส้นโค้ง AC เข้ากันได้ดีกับแบบจำลองการแพร่กระจายที่มีองค์ประกอบเดียว (Eq. 4) โดยที่โปรตีนโมโนเมอร์มีค่าสัมประสิทธิ์การแพร่กระจายที่คาดหวัง (รูปที่ 7b ) แผงด้านขวา)ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่ของอนุภาคที่รวมตัวมีค่าน้อยกว่า 1 µm2/วินาที และค่าสัมประสิทธิ์การแพร่ของโปรตีนโมโนเมอร์มีค่าประมาณ 1 µm2/วินาที50–100 ไมโครเมตร/วินาที;ค่าจะคล้ายกับค่าที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้สำหรับ sonicated αS amyloid fibrils และ monomeric αS แยกกันภายใต้เงื่อนไขการแก้ปัญหาที่คล้ายกันเมื่อเราวิเคราะห์มวลรวมด้วยการวิเคราะห์การระเบิด TCCD (รูปที่ 7c แผงด้านบน) เราพบว่าในแต่ละมวลรวมที่แยกได้ (αS/Tau heteroaggregate) ประมาณ 60% ของมวลรวมที่ตรวจพบมีทั้ง αS และ tau ประมาณ 30% มีเพียง เอกภาพ ประมาณ 10% αS เท่านั้นการวิเคราะห์ปริมาณสารสัมพันธ์ของเฮเทอโรเอกรีเกทของ αS/Tau แสดงให้เห็นว่าเฮเทอโรอะกรีเกตส่วนใหญ่อุดมไปด้วยเอกภาพ (ปริมาณสารสัมพันธ์ต่ำกว่า 0.5 จำนวนเฉลี่ยของโมเลกุลเอกภาพต่อการรวมมากกว่าโมเลกุล αS 4 เท่า) ซึ่งสอดคล้องกับงานของเราที่สังเกตได้ใน FLIM ในแหล่งกำเนิด การทดลอง.การวิเคราะห์ FRET แสดงให้เห็นว่ามวลรวมเหล่านี้มีโปรตีนทั้งสอง แม้ว่าค่า FRET จริงในกรณีนี้จะไม่มีความสำคัญมากนัก เนื่องจากการกระจายตัวของฟลูออโรฟอร์ในแต่ละมวลรวมเป็นแบบสุ่มเนื่องจากมีโปรตีนที่ไม่มีป้ายกำกับมากเกินไปที่ใช้ในการทดลองที่น่าสนใจคือเมื่อเราทำการวิเคราะห์แบบเดียวกันโดยใช้ตัวแปรเทาว์ที่ขาดการรวมตัวของอะไมลอยด์ที่เป็นผู้ใหญ่ 45,46 ตัว (ดูรูปที่ 11a, b เพิ่มเติม) เราสังเกตเห็นว่าถึงแม้ว่าการรวมตัวของไฟฟ้าสถิต αS จะเหมือนกัน (รูปที่ 11c เสริม, d) ความสามารถในการสร้างมวลรวมภายใน coacervate ลดลงอย่างมาก และ FLIM ตรวจพบจุดต่างๆ ในการทดลอง ในแหล่งกำเนิด และสังเกตเส้นโค้งความสัมพันธ์ข้ามที่อ่อนแอสำหรับตัวอย่างมวลรวมที่แยกได้อย่างไรก็ตาม สำหรับมวลรวมที่ตรวจพบจำนวนเล็กน้อย (เพียงหนึ่งในสิบของ Tau441) เราสังเกตว่าแต่ละมวลรวมได้รับการเสริมสมรรถนะใน αS มากกว่าตัวแปร Tau นี้ โดยประมาณ 50% ของมวลรวมที่ตรวจพบมีเพียง αS โมเลกุลเท่านั้น และ αS นั้นต่างกันเกิน .มวลรวม (ดูรูปที่ 11e เพิ่มเติม) ตรงกันข้ามกับมวลรวมที่ต่างกันที่สร้างโดย Tau441 (รูปที่ 6f)ผลการทดลองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าแม้ว่า αS เองจะสามารถสะสมกับเทาว์ภายใน coacervate ได้ แต่การเกิดนิวเคลียสของเทาจะดีกว่าภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ และผลรวมกลุ่มที่คล้ายอะไมลอยด์ก็สามารถทำหน้าที่เป็นรูปแบบของ αS และเทาได้อย่างไรก็ตาม เมื่อแกนกลางที่มีเอกภาพมากถูกสร้างขึ้น ปฏิกิริยาระหว่างเฮเทอโรไทป์ระหว่าง αS และเอกภาพได้รับการสนับสนุนในการรวมตัวมากกว่าปฏิกิริยาแบบโฮโมไทปิกระหว่างโมเลกุลเอกภาพเรายังสังเกตเครือข่ายโปรตีนในของเหลว αS / tau coacervates
ร่องรอยชั่วคราวเรืองแสงที่เป็นตัวแทนของโมเลกุลเดี่ยวของมวลรวมที่แยกได้ที่เกิดขึ้นใน coacervates ไฟฟ้าสถิต αS/Tau441การระเบิดที่สอดคล้องกับ αS / Tau441 coaggregates (การระเบิดเหนือเกณฑ์ที่ระบุ) ถูกสังเกตในช่องการตรวจจับสามช่อง (การปล่อย AF488 และ Atto647N หลังจากการกระตุ้นโดยตรง, เส้นสีน้ำเงินและสีแดง, การปล่อย Atto647N หลังจากการกระตุ้นทางอ้อม), FRET, เส้นสีม่วง)b การวิเคราะห์ FCS/FCCS ของตัวอย่างของมวลรวม αS/Tau441 ที่แยกได้ที่ได้รับจาก LLPS (แผงด้านซ้าย)เส้นโค้งความสัมพันธ์อัตโนมัติ (AC) สำหรับ AF488 และ Atto647N จะแสดงเป็นสีน้ำเงินและสีแดง ตามลำดับ และเส้นโค้งความสัมพันธ์ข้าม (CC) ที่เกี่ยวข้องกับผลรวมที่มีสีย้อมทั้งสองจะแสดงเป็นสีม่วงเส้นโค้ง AC สะท้อนถึงการมีอยู่ของสปีชีส์โปรตีนแบบมอนอเมอร์และแบบรวมกลุ่มที่มีการปิดฉลาก ในขณะที่เส้นโค้ง CC แสดงเฉพาะการแพร่กระจายของมวลรวมที่มีการปิดฉลากสองชั้นเท่านั้นการวิเคราะห์เดียวกัน แต่ภายใต้เงื่อนไขของสารละลายเดียวกันกับในจุดที่แยกได้ ตัวอย่างที่มีเฉพาะโมโนเมอร์ αS และ Tau441 จะแสดงเป็นตัวควบคุมในแผงด้านขวาc การวิเคราะห์แฟลชเรืองแสงของโมเลกุลเดี่ยวของมวลรวมที่แยกได้ที่เกิดขึ้นใน coacervates ไฟฟ้าสถิต αS / Tau441ข้อมูลสำหรับแต่ละการรวมกลุ่มที่พบในการทำซ้ำสี่ครั้งที่แตกต่างกัน (N = 152) จะถูกพล็อตเทียบกับปริมาณสัมพันธ์ ค่า S และประสิทธิภาพของ FRET (แผงด้านบน แถบสีสะท้อนถึงการเกิดขึ้น)การรวมกลุ่มสามประเภทสามารถแยกแยะได้: -การรวมกลุ่ม Tau/αS เท่านั้นที่มี S~1 และ FRET~0, การรวมกลุ่ม Tau เท่านั้นที่มี S~0 และ FRET~1 และการรวมกลุ่ม Tau/αS ที่ต่างกันกับ S และ FRET ระดับกลาง การประมาณค่าของจำนวน ของโปรตีนมาร์กเกอร์ทั้งสองที่ตรวจพบในแต่ละมวลรวมที่ต่างกัน (N = 100) จะแสดงในแผงด้านล่าง (ระดับสีสะท้อนถึงการเกิดขึ้น)ข้อมูลดิบจะถูกจัดเตรียมไว้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลดิบ
มีรายงานว่าการสุกหรือแก่ของโปรตีนเหลวคอนเดนเสทไปเป็นโครงสร้างคล้ายเจลหรือแข็งเมื่อเวลาผ่านไปมีรายงานว่าเกี่ยวข้องกับการทำงานทางสรีรวิทยาหลายประการของคอนเดนเสท เช่นเดียวกับในโรค เนื่องจากเป็นกระบวนการที่ผิดปกติก่อนการรวมตัวของอะไมลอยด์ 7, 48, 49 ที่นี่ เราศึกษาการแยกเฟสและพฤติกรรมโดยละเอียดLSPT αS ในการมีอยู่ของโพลิแคตชันแบบสุ่มในสภาพแวดล้อมที่มีการควบคุมที่ความเข้มข้นของไมโครโมลาร์ต่ำและสภาวะที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา (โปรดสังเกตว่าความเข้มข้นทางสรีรวิทยาที่คำนวณของ αS คือ >1 µM50) ตามพฤติกรรมที่ขับเคลื่อนด้วยอุณหพลศาสตร์ทั่วไปของ LPSเราพบว่า αS ซึ่งมีบริเวณปลาย C ที่มีประจุลบสูงที่ pH ทางสรีรวิทยา สามารถสร้างหยดที่อุดมด้วยโปรตีนในสารละลายที่เป็นน้ำผ่าน LLPS ในที่ที่มีเปปไทด์ที่มีประจุบวกสูง เช่น pLK หรือ Tau ผ่านกระบวนการของไฟฟ้าสถิต การควบแน่นที่ซับซ้อนต่อหน้าโมเลกุลขนาดใหญ่ที่รวมตัวกันกระบวนการนี้อาจมีผลกระทบที่เกี่ยวข้องในสภาพแวดล้อมของเซลล์ โดยที่ αS พบโมเลกุลโพลีแคตไอออนิกต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการรวมกลุ่มที่เกี่ยวข้องกับโรคทั้ง ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย 51,52,53,54
ในการศึกษาจำนวนมาก การเปลี่ยนแปลงของโปรตีนภายในหยดได้รับการพิจารณาว่าเป็นหนึ่งในปัจจัยสำคัญที่กำหนดกระบวนการเจริญเติบโตในไฟฟ้าสถิต αS coacervates กับ polycations กระบวนการสุกเต็มที่ขึ้นอยู่กับความแข็งแกร่งของอันตรกิริยากับ polycations ความจุ และความหลากหลายของอันตรกิริยาเหล่านี้ทฤษฎีสมดุลเสนอว่าภูมิทัศน์สมดุลของสถานะของเหลวสองสถานะคือการมีอยู่ของหยดขนาดใหญ่ที่อุดมไปด้วยโพลีเมอร์ชีวภาพที่ขับเคลื่อน LLPS57,58การเจริญเติบโตของหยดสามารถทำได้โดยการเจริญเติบโตของ Ostwald, การรวมตัวกัน หรือการบริโภคโมโนเมอร์อิสระในระยะที่กระจายตัว 61สำหรับ αS และ Tau441, ΔNt-Tau หรือ pLK โปรตีนส่วนใหญ่เข้มข้นในคอนเดนเสทภายใต้เงื่อนไขที่ใช้ในการศึกษานี้อย่างไรก็ตาม ในขณะที่หยดหยดเทาว์ขนาดเต็มรวมตัวกันอย่างรวดเร็วเมื่อพื้นผิวเปียก หยดรวมตัวกันและการทำให้เปียกนั้นเป็นเรื่องยากสำหรับ ΔNt-Tau และ pLK ซึ่งบ่งบอกถึงการสูญเสียคุณสมบัติของของเหลวอย่างรวดเร็วในทั้งสองระบบนี้จากการวิเคราะห์ FLIM-FRET ของเรา หยด pLK และ ΔNt-Tau ที่มีอายุมากแสดงการรวมตัวของโปรตีนในระดับที่ใกล้เคียงกัน (อายุการเรืองแสงที่คล้ายกัน) เหมือนกับหยดดั้งเดิม ซึ่งบ่งบอกว่าเครือข่ายโปรตีนดั้งเดิมยังคงอยู่ แม้ว่าจะเข้มงวดกว่าก็ตาม
เราหาเหตุผลเข้าข้างตนเองผลการทดลองของเราในรูปแบบต่อไปนี้ (รูปที่ 8)หยดที่ก่อตัวชั่วคราวในช่วงแรกมักเป็นโครงข่ายโปรตีนที่ไม่มีการชดเชยไฟฟ้าสถิต และทำให้เกิดความไม่สมดุลของประจุ โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ส่วนต่อประสานของหยด ส่งผลให้หยดมีศักยภาพที่พื้นผิวของไฟฟ้าสถิตสูงเพื่อชดเชยประจุ (ปรากฏการณ์ที่เรียกกันทั่วไปว่าวาเลนซ์พร่อง) และลดศักยภาพพื้นผิวของหยดให้เหลือน้อยที่สุด หยดสามารถรวมโพลีเปปไทด์ใหม่จากเฟสเจือจาง จัดโครงสร้างเครือข่ายโปรตีนใหม่เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของปฏิกิริยาระหว่างประจุกับประจุ และโต้ตอบกับหยดอื่น ๆมีพื้นผิว (เปียก)หยด αS/pLK เนื่องจากเครือข่ายโปรตีนที่เรียบง่ายกว่า (เฉพาะปฏิกิริยาแบบเฮเทอโรไทป์ระหว่าง αS และ pLK) และความสัมพันธ์ที่มากขึ้นสำหรับปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีน ดูเหมือนจะสามารถปรับสมดุลประจุของคอนเดนเสทได้รวดเร็วยิ่งขึ้นแท้จริงแล้วเราสังเกตจลนพลศาสตร์ของโปรตีนที่เร็วกว่าใน αS / pLK coacervates ที่เกิดขึ้นเริ่มแรกมากกว่าใน αS / Tauหลังจากเวเลนซ์หมดลง ปฏิกิริยาจะเกิดขึ้นชั่วคราวน้อยลง และหยดจะสูญเสียคุณสมบัติของเหลวและกลายเป็นหยดที่มีลักษณะคล้ายเจลและไม่ติดไฟซึ่งมีศักย์ไฟฟ้าบนพื้นผิวต่ำ (และทำให้พื้นผิวเปียกไม่ได้)ในทางตรงกันข้าม หยด αS/Tau มีประสิทธิภาพน้อยกว่าในการปรับสมดุลประจุหยดให้เหมาะสม เนื่องจากเครือข่ายโปรตีนที่ซับซ้อนมากขึ้น (ที่มีปฏิสัมพันธ์ทั้งแบบโฮโมไทป์และเฮเทอโรไทปิก) และธรรมชาติที่อ่อนแอกว่าของปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนซึ่งส่งผลให้หยดจะคงพฤติกรรมของของเหลวไว้เป็นระยะเวลานานและมีศักยภาพของพื้นผิวที่เป็นไฟฟ้าสถิตสูง ซึ่งมีแนวโน้มว่าจะลดลงโดยการรวมตัวกันและการเติบโต (ซึ่งจะเป็นการลดพื้นที่ผิว/อัตราส่วนปริมาตรของหยด) และโดยการทำให้เคมีพื้นผิวที่ชอบน้ำเปียกสิ่งนี้จะสร้างคลังโปรตีนที่มีความเข้มข้นขนาดใหญ่ซึ่งยังคงรักษาคุณสมบัติของของไหลไว้ เนื่องจากปฏิกิริยายังคงเกิดขึ้นชั่วคราวมากเนื่องจากการค้นหาการหาค่าเหมาะที่สุดประจุในเครือข่ายโปรตีนอย่างต่อเนื่องสิ่งที่น่าสนใจคือรูปแบบของ Tau ที่ถูกตัดทอนด้วยปลาย N รวมถึงไอโซฟอร์มที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติบางชนิดแสดงพฤติกรรมระดับกลาง โดยบางชนิดจะ coacervates อายุด้วย α S ให้เป็นหยดคล้ายเจลที่มีอายุยืนยาว ในขณะที่บางชนิดเปลี่ยนเป็นคอนเดนเสทของเหลวขนาดใหญ่ความเป็นคู่ในการสุกของ coacervates ไฟฟ้าสถิต αS นี้สอดคล้องกับการศึกษาเชิงทฤษฎีและเชิงทดลองของ LLPS ล่าสุดที่ได้ระบุความสัมพันธ์ระหว่างการสูญเสียความจุและการร่อนด้วยไฟฟ้าสถิตในคอนเดนเสทซึ่งเป็นกุญแจสำคัญในการควบคุมขนาดคอนเดนเสทและคุณสมบัติของของไหลกลไก 58.61.
แบบแผนนี้แสดงวิถีการรวมตัวของอะไมลอยด์สมมุติสำหรับ αS และ Tau441 ผ่านทาง LLPS และ LSPTด้วยบริเวณที่อุดมด้วยประจุลบ (สีแดง) และไอออนบวก (สีน้ำเงิน) เพิ่มเติม αS และ tau electrostatic coacervates ที่มีเวเลนซ์ที่น่าพอใจจะมีพลังงานพื้นผิวที่ต่ำกว่า ดังนั้นจึงมีการรวมตัวกันน้อยลง ส่งผลให้เกิดการเสื่อมสภาพของหยดอย่างรวดเร็วได้สถานะเจลที่ไม่จับตัวเป็นก้อนที่เสถียร.สถานการณ์นี้เอื้ออำนวยอย่างมากในกรณีของระบบ αS/pLK เนื่องจากความสัมพันธ์ที่สูงกว่าและเครือข่ายอันตรกิริยาระหว่างคู่โปรตีนที่ง่ายกว่า ซึ่งช่วยให้เกิดการเปลี่ยนแปลงคล้ายเจลที่รวดเร็วในทางตรงกันข้าม หยดที่มีเวเลนซ์ที่ไม่น่าพอใจและด้วยเหตุนี้ บริเวณที่มีประจุโปรตีนจึงพร้อมสำหรับการโต้ตอบ ช่วยให้ coacervate สามารถหลอมรวมและทำให้พื้นผิวที่ชอบน้ำเปียกได้ง่ายขึ้น เพื่อลดพลังงานพื้นผิวที่สูงสถานการณ์นี้ดีกว่าสำหรับ coacervates αS/Tau441 ซึ่งมีเครือข่ายที่ซับซ้อนหลายวาเลนท์ซึ่งประกอบด้วยปฏิสัมพันธ์ Tau-Tau และ αS-Tau ที่อ่อนแอในทางกลับกัน coacervates ที่ใหญ่กว่าจะคงคุณสมบัติคล้ายของเหลวไว้ได้ง่ายขึ้น ทำให้เกิดปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีนอื่นๆ ได้ในที่สุด สารรวมกลุ่มที่ต่างกันของอะไมลอยด์ที่มีทั้ง αS และเทาก่อตัวขึ้นภายในของเหลวโคเซอร์เวต ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับสิ่งที่พบในส่วนการรวมเข้า ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของโรคความเสื่อมของระบบประสาท
โครงสร้างคล้ายของเหลวขนาดใหญ่เกิดขึ้นระหว่างการเจริญเติบโตของ αS/Tau441 โดยมีสภาพแวดล้อมโปรตีนที่หนาแน่นสูง แต่มีไดนามิก และในระดับที่น้อยกว่า coacervates αS/ΔNt-Tau เป็นแหล่งกักเก็บในอุดมคติสำหรับการเกิดนิวเคลียสของการรวมตัวของโปรตีนเราได้สังเกตการก่อตัวของการรวมตัวของโปรตีนที่เป็นของแข็งในโปรตีน coacervates ประเภทนี้ ซึ่งมักจะมีทั้ง αS และเทาเราได้แสดงให้เห็นว่าการรวมกลุ่มที่แตกต่างกันเหล่านี้มีความเสถียรโดยปฏิกิริยาที่ไม่ใช่ไฟฟ้าสถิต สามารถผูกสีย้อม ThT ที่จำเพาะต่ออะไมลอยด์ได้ในลักษณะเดียวกับไฟบริลอะไมลอยด์ทั่วไป และมีความต้านทานต่ออิทธิพลต่าง ๆ ที่คล้ายกันสารรวมกลุ่ม αS/เทาที่ก่อรูปโดย LLPS แสดงให้เห็นว่ามีคุณสมบัติคล้ายอะไมลอยด์แท้จริงแล้วตัวแปรที่สมบูรณ์ของเทาว์ที่ขาดในการรวมตัวของอะไมลอยด์นั้นมีความบกพร่องอย่างมีนัยสำคัญในการก่อตัวของการรวมตัวของ αS ที่ต่างกันเหล่านี้ภายใน coacervate ไฟฟ้าสถิตที่เป็นของเหลวการก่อตัวของมวลรวม αS/Tau441 ถูกสังเกตเฉพาะภายในโคเซอร์เวต ซึ่งยังคงคุณสมบัติคล้ายของเหลวไว้ และไม่เคยเกิดขึ้นเลย หากโคเซอร์เวต/หยดไปไม่ถึงสถานะเจลในกรณีหลัง ความแข็งแรงที่เพิ่มขึ้นของปฏิกิริยาระหว่างไฟฟ้าสถิต และผลที่ตามมาคือความแข็งแกร่งของโครงข่ายโปรตีนป้องกันการจัดเรียงโครงสร้างใหม่ของโปรตีนที่จำเป็นเพื่อสร้างปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนใหม่ที่จำเป็นสำหรับการสร้างนิวเคลียสของอะไมลอยด์อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้สามารถทำได้ในโคเซอร์เวตที่มีลักษณะคล้ายของเหลวที่มีความยืดหยุ่นมากกว่า ซึ่งในทางกลับกันมีแนวโน้มที่จะยังคงเป็นของเหลวอยู่เมื่อมีขนาดเพิ่มขึ้น
ความจริงที่ว่าการก่อตัวของมวลรวมภายในเฟสควบแน่นนั้นดีกว่าในการควบแน่น αS/Tau ขนาดใหญ่มากกว่าในหยดขนาดเล็กที่เจลอย่างรวดเร็ว เน้นย้ำถึงความเกี่ยวข้องของการระบุปัจจัยที่ควบคุมการรวมตัวกันของหยดดังนั้นไม่เพียงแต่มีแนวโน้มที่จะแยกเฟสเท่านั้น แต่ยังต้องควบคุมขนาดของคอนเดนเสทเพื่อให้การทำงานที่เหมาะสมและการป้องกันโรค58,61ผลลัพธ์ของเรายังเน้นถึงความสำคัญของความสมดุลระหว่าง LLPS และ LSPT สำหรับระบบ αS/Tauในขณะที่การก่อตัวของหยดอาจป้องกันการรวมตัวของอะไมลอยด์โดยการลดปริมาณของโมโนเมอร์โปรตีนที่มีอยู่ภายใต้สภาวะความอิ่มตัว ตามที่เสนอไว้ในระบบอื่น 63,64 การรวมตัวของหยดที่ระดับหยดสูงอาจนำไปสู่การรวมตัวของโปรตีนภายในผ่านการจัดเรียงโครงสร้างใหม่ช้าเครือข่ายโปรตีน.
โดยรวมแล้ว ข้อมูลของเราเน้นย้ำถึงความเกี่ยวข้องของความจุที่สอดคล้องกันและการโต้ตอบที่พอใจ/ไม่พอใจในเครือข่ายแบบดรอปในบริบทของ LSPTโดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราแสดงให้เห็นว่าคอนเดนเสท αS/Tau441 แบบเต็มความยาวสามารถหลอมรวมและนิวเคลียสได้อย่างมีประสิทธิภาพเพื่อสร้างเฮเทอโรอะกรีเกตที่มีลักษณะคล้ายอะไมลอยด์ที่มีทั้งโปรตีนและเสนอกลไกระดับโมเลกุลตามผลการทดลองของเราการรวมตัวร่วมกันของโปรตีนสองตัวใน coacervate ของไหล αS/Tau ที่เรารายงานที่นี่อาจเกี่ยวข้องกับการแปลร่วมของโปรตีนสองตัวในการรวมเข้าด้วยกัน ซึ่งเป็นจุดเด่นของโรค และอาจมีส่วนช่วยให้เข้าใจความสัมพันธ์ระหว่าง LLPS และ การรวมตัวของอะไมลอยด์ ปูทางไปสู่ ​​IDP ที่มีประจุสูงในการเสื่อมของระบบประสาท
Monomeric WT-αS, cysteine ​​​​กลายพันธุ์ (Q24C-αS, N122C-αS) และตัวแปรΔCt-αS (Δ101-140) ถูกแสดงใน E. coli และทำให้บริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า5 mM DTT ถูกรวมไว้ในทุกขั้นตอนในการทำให้บริสุทธิ์ของการกลายพันธุ์ของαS cysteine ​​\u200b\u200bเพื่อป้องกันการเกิดพันธะไดซัลไฟด์TAU441 isoform (พลาสมิดที่ได้จาก addgene #16316), ตัวแปรΔnt-tau (Δ1–150, ที่ได้จากการโคลน IVA กับไพรเมอร์ ctttaagaaggataCatatatgatcgccaccggcgg, catatgtatctctcttctttta ) E. coli วัฒนธรรมคือ เพิ่มขึ้นเป็น OD600 = 0.6–0.7 ที่ 37°C และ 180 rpm และแสดงออกด้วย IPTG เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37°Cเก็บเซลล์ที่ 11,500 xg เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 °C และล้างด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ที่มี NaCl 150 มิลลิโมลาร์แขวนตะกอนเม็ดอีกครั้งในบัฟเฟอร์สลาย (20 มล. ต่อ 1 ลิตร LB: MES 20 มิลลิโมลาร์, pH 6.8, NaCl 500 มิลลิโมลาร์, EDTA 1 มิลลิโมลาร์, MgCl2 0.2 มิลลิโมลาร์, DTT 5 มิลลิโมลาร์, PMSF 1 มิลลิโมลาร์, เบนซามิดีน 50 ไมโครโมลาร์, โคเปปติน 100 ไมโครโมลาร์)ขั้นตอนการโซนิคถูกดำเนินการบนน้ำแข็งที่มีแอมพลิจูด 80% สำหรับ 10 พัลส์ (เปิด 1 นาที, ปิด 1 นาที)ไม่เกิน 60 มล. ในอัลตราซาวนด์ครั้งเดียวเชื้อ E. coli lysates ถูกทำให้ร้อนที่ 95° C เป็นเวลา 20 นาที จากนั้นทำให้เย็นบนน้ำแข็งและปั่นเหวี่ยงที่ 127,000×g เป็นเวลา 40 นาทีส่วนลอยเหนือตะกอนที่ถูกทำให้ใสถูกนำไปใช้กับเมมเบรน 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) และไดอะไลซ์เทียบกับบัฟเฟอร์การฟอกไต 4 ลิตร (MES 20 มิลลิโมลาร์, pH 6.8, NaCl 50 มิลลิโมลาร์, EDTA 1 มิลลิโมลาร์, MgCl2 2 มิลลิโมลาร์, DTT 2 มิลลิโมลาร์ , PMSF 0.1 มิลลิโมลาร์) เป็นเวลา 10 ชั่วโมงคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนบวก 5 มล. (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ปรับสมดุลด้วยบัฟเฟอร์การปรับสมดุล (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF)เทาไลเซตถูกกรองผ่านตัวกรอง PVDF 0.22 ไมโครเมตร และฉีดเข้าไปในคอลัมน์ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร/นาทีการชะถูกดำเนินการทีละน้อย โดยชะเทาด้วยบัฟเฟอร์การชะ 15–30% (20 มิลลิโมลาร์ MES, pH 6.8, 1 โมลาร์ NaCl, 1 มิลลิโมลาร์ EDTA, 2 มิลลิโมลาร์ MgCl2, 2 มิลลิโมลาร์ DTT, 0.1 มิลลิโมลาร์ PMSF)เศษส่วนถูกวิเคราะห์โดย SDS-PAGE และเศษส่วนใดๆ ที่มีหนึ่งแบนด์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลที่คาดหวังของเทาถูกทำให้เข้มข้นโดยใช้ตัวกรองแบบหมุนเหวี่ยงขนาด 10 กิโลดาลตัน และแทนที่ด้วยบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 10 มิลลิโมลาร์ HEPES, pH 7.4, NaCl 500 มิลลิโมลาร์ และ DTT 2 มิลลิโมลาร์สำหรับ ความเข้มข้นของโปรตีนสุดท้ายคือ 100 ไมโครโมลาร์จากนั้นสารละลายโปรตีนถูกส่งผ่านตัวกรอง PVDF ขนาด 0.22 ไมโครเมตร แช่แข็งอย่างรวดเร็วและเก็บไว้ที่ -80°Cโปรดให้โปรตีน K18 โดยศาสตราจารย์ Alberto Boffiความบริสุทธิ์ของสารเตรียมคือ >95% ตามที่ยืนยันโดย SDS-PAGE และ MALDI-TOF/TOFซีสเตอีนหลายชนิดถูกติดฉลากทางเคมีด้วย AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) หรือ TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada)ได้รับการยืนยันโดยการดูดกลืนแสงและ MALDI-TOF/TOFTau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau และ K18 ถูกติดป้ายกำกับด้วยซีสเตอีนตกค้างพื้นเมืองที่ตำแหน่ง 191 และ 322 โดยใช้ Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) ตามขั้นตอนเดียวกันประจุสุทธิต่อแมปเรซิดิวสำหรับ αS และ Tau441 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ CIDER66
โพลี-แอล-ไลซีนที่เป็นของแข็ง (pLK DP 90-110 ตาม NMR จากซัพพลายเออร์, Alamanda Polymers Inc, ฮันต์สวิลล์, แอละแบมา, สหรัฐอเมริกา) ถูกละลายใน 10 มิลลิโมลาร์ HEPES, 100 มิลลิโมลาร์ NaCl, ความเข้มข้น pH 7.4 ถึง 10 มิลลิโมลาร์, กระบวนการ sonicated เป็นเวลา 5 นาทีในอ่างน้ำอัลตราโซนิก และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°CPEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, วอเตอร์ทาวน์, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) และ FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, ซานต์หลุยส์, มิชิแกน, สหรัฐอเมริกา) ละลายน้ำได้และมีการกระจายอย่างกว้างขวางในบัฟเฟอร์ LLPSการฟอกไตจะขจัดเกลือที่ปนเปื้อนจากนั้นกรองผ่านตัวกรองเข็มฉีดยาที่มีรูพรุนขนาด 0.22 μm และคำนวณความเข้มข้นโดยใช้เครื่องวัดการหักเหของแสง (Mettler Toledo, โคลัมบัส, โอไฮโอ, สหรัฐอเมริกา)ตัวอย่าง LLPS ถูกเตรียมที่อุณหภูมิห้องตามลำดับต่อไปนี้: บัฟเฟอร์และการอัดขึ้นรูปถูกผสมและทริส(2-คาร์บอกซีเอทิล)ฟอสฟีน 1 มิลลิโมลาร์ (TCEP, คาร์โบซินธ์, คอมป์ตัน, สหราชอาณาจักร), 1 มิลลิโมลาร์ 2,2,2,2-(อีเทน- 1, 2-ไดอิลไดไนไตรล์) กรดเตตราอะซิติก (EDTA, คาร์บอกซินธ์) และของผสมของตัวยับยั้งโปรตีเอส 1% (PMSF 100 มิลลิโมลาร์, เบนซิไมด์ 1 มิลลิโมลาร์, ลิวเพปติน 5 ไมโครโมลาร์)จากนั้น αS และโพลีแคตแบบหลอมรวม (ตัวเลือก pLK หรือ Tau) จะถูกเพิ่มเข้าไปสำหรับการทดลองอนุกรมเวลาของไทโอฟลาวิน-T (ThT, คาร์โบซินธ์, คอมป์ตัน, สหราชอาณาจักร) ให้ใช้ความเข้มข้นของ ThT ทั้งหมดเป็นครึ่งหนึ่งของความเข้มข้น αSผสมตัวอย่างเบาๆ แต่ทั่วถึงเพื่อให้แน่ใจว่าเป็นเนื้อเดียวกันความเข้มข้นของส่วนประกอบแต่ละอย่างแตกต่างกันไปในแต่ละการทดลอง ตามที่อธิบายไว้ในส่วนผลลัพธ์เอไซด์ถูกใช้ที่ความเข้มข้น 0.02% (น้ำหนัก/ปริมาตร) เมื่อใดก็ตามที่ระยะเวลาของการทดลองเกิน 4 ชั่วโมงสำหรับการวิเคราะห์ทั้งหมดโดยใช้ตัวอย่าง LLPS ปล่อยให้ของผสมปรับสมดุลเป็นเวลา 5 นาทีก่อนการวิเคราะห์สำหรับการวิเคราะห์การกระเจิงของแสง ตัวอย่าง 150 µl ถูกโหลดลงบนไมโครเพลท 96 หลุมที่ไม่มีพันธะ (µClear®, สีดำ, หลุม F-Bottom/ปล่องไฟ, Greiner bio-one, Kremsmünster, ออสเตรีย) และปิดด้วยฟิล์มกาวLLP ได้รับการตรวจสอบโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่ 350 นาโนเมตรที่ศูนย์กลางของสารละลายในเครื่องอ่านเพลต CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Germany)การทดลองดำเนินการเป็นสามเท่าที่อุณหภูมิ 25°C และข้อผิดพลาดถูกคำนวณเป็นส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานจากค่าเฉลี่ยเฟสเจือจางถูกหาปริมาณโดยการปั่นแยกตัวอย่างและการวิเคราะห์เจล SDS-PAGE และเศษส่วน αS ในเฟสเจือจางและเข้มข้นถูกหาปริมาณในสารละลาย LLPS ต่างๆตัวอย่าง LLPS ขนาด 100 ไมโครลิตรที่ประกอบด้วย αS ที่ติดฉลาก AF488 1 ไมโครโมลาร์ ถูกเตรียมโดยการผสมอย่างละเอียดตามด้วยการปั่นแยกที่ 9600×กรัม เป็นเวลา 30 นาที หลังจากนั้นมักจะมองเห็นตะกอนได้ส่วนลอยเหนือตะกอน 50 ไมโครลิตรด้านบนถูกใช้สำหรับการหาปริมาณโปรตีนโดยใช้เจล SDS-PAGEสแกนเจลด้วยฟิลเตอร์ AF488 โดยใช้ระบบถ่ายภาพเจล ChemiDoc (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, Hercules, CA, USA) หรือย้อมด้วยคราบ Coomassie และมองเห็นด้วยตัวกรองที่เหมาะสมวิเคราะห์แถบผลลัพธ์โดยใช้ ImageJ เวอร์ชัน 1.53i (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ สหรัฐอเมริกา)การทดลองดำเนินการซ้ำกันในการทดลองที่แตกต่างกันสองรายการซึ่งมีผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน
โดยทั่วไปแล้ว ตัวอย่าง 150 μl ถูกนำไปใช้กับไมโครเพลท 96 หลุมที่ไม่มีพันธะและมองเห็นได้ที่อุณหภูมิห้องบนกล้องจุลทรรศน์กลับหัว Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)สำหรับการทดลองเฉพาะจุด ยังใช้เพลต µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, เยอรมนี) หรือไมโครเพลทโพลีสไตรีน 96 หลุม (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ก็ถูกนำมาใช้เช่นกันหลอดฮาโลเจน EL6000 หรือหลอดเมทัลฮาไลด์ปรอทถูกใช้เป็นแหล่งแสงสว่าง (สำหรับการถ่ายภาพ BF/DIC และ WF ตามลำดับ)สำหรับกล้องจุลทรรศน์ WF นั้น มีการใช้วัตถุประสงค์ทางอากาศที่กำลังขยาย 40 เท่า (ไลก้า ไมโครซิสเต็มส์ ประเทศเยอรมนี) เพื่อเน้นแสงไปที่ตัวอย่างและรวบรวมมันสำหรับตัวอย่างที่มีป้ายกำกับ AF488 และ ThT ให้กระตุ้นและการปล่อยตัวกรองด้วยชุดตัวกรอง GFP มาตรฐาน ตัวกรองแบนด์พาสการกระตุ้นและการปล่อย ตามลำดับ ตัวกรองแบนด์พาส 460–500 นาโนเมตร และ 512–542 นาโนเมตร และกระจกไดโครอิก 495 นาโนเมตร ตามลำดับสำหรับตัวอย่างที่มีป้ายกำกับด้วย Atto647N จะใช้ชุดตัวกรอง Cy5 มาตรฐานที่มีตัวกรอง bandpass การกระตุ้นและการปล่อยคลื่น 628–40 nm และ 692–40 nm ตามลำดับ และใช้กระจกไดโครอิก 660 นาโนเมตรสำหรับกล้องจุลทรรศน์ BF และ DIC ให้ใช้วัตถุประสงค์ในการเก็บรวบรวมแสงสะท้อนเดียวกันแสงที่รวบรวมได้จะถูกบันทึกไว้ในกล้อง CCD ของ Leica DFC7000 (Leica Microsystems ประเทศเยอรมนี)เวลาเปิดรับแสงคือ 50 มิลลิวินาทีสำหรับการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ BF และ DIC และ 20-100 มิลลิวินาทีสำหรับการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ WFสำหรับการเปรียบเทียบ เวลาเปิดรับแสงสำหรับการทดลองทั้งหมดด้วย ThT คือ 100 มิลลิวินาทีทำการทดลองแบบไทม์แลปส์เพื่อแสดงภาพการรวมตัวกันของหยด โดยมีการรวบรวมภาพทุกๆ 100 มิลลิวินาทีเป็นเวลาหลายนาทีImageJ (NIH, USA) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ภาพการทดลองดำเนินการเป็นสามเท่าโดยให้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน
สำหรับการทดลอง colocalization, FRAP และการสร้าง 3D ใหม่นั้น จะได้ภาพจากกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบกลับหัว Zeiss LSM 880 โดยใช้ ZEN 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)ตัวอย่าง 50 µl ถูกนำไปใช้กับจานเพาะเชื้อ µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, ประเทศเยอรมนี) บำบัดด้วยโพลีเมอร์ที่ชอบน้ำ (ibiTreat) และติดตั้งในวัตถุประสงค์การแช่น้ำมัน 63 × (Plan-Apochromat 63 × / น้ำมัน NA 1.4) บนดีไอซี)ภาพได้มาโดยใช้เส้นเลเซอร์อาร์กอน 458 นาโนเมตร 488 นาโนเมตร และ 633 นาโนเมตรที่มีความละเอียด 0.26 ไมโครเมตร/พิกเซล และเวลาเปิดรับแสง 8 ไมโครวินาที/พิกเซล สำหรับหน้าต่างการตรวจจับการกระตุ้นและการปล่อยก๊าซเรือนกระจกที่ 470–600 นาโนเมตร 493–628 นาโนเมตร และ 638–755 นาโนเมตรใช้ในการเห็นภาพ ThT, AF488 และ Atto647N ตามลำดับสำหรับการทดลอง FRAP การถ่ายภาพเหลื่อมเวลาของแต่ละตัวอย่างจะถูกบันทึกที่ 1 เฟรมต่อวินาทีการทดลองดำเนินการเป็นสามเท่าที่อุณหภูมิห้องโดยให้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันภาพทั้งหมดวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)เส้นโค้ง FRAP ได้รับการทำให้เป็นมาตรฐาน ลงจุด และติดตั้งข้อมูลความเข้ม/เวลาที่แยกจากรูปภาพโดยใช้ Zen 2 โดยใช้ OriginPro 9.1เส้นโค้งการฟื้นตัวถูกปรับให้เข้ากับแบบจำลองเอ็กซ์โพเนนเชียลเอกซ์โปเนนเชียลเพื่อพิจารณาถึงการแพร่กระจายของโมเลกุลพร้อมกับคำเอ็กซ์โพเนนเชียลเพิ่มเติมเพื่อพิจารณาถึงผลการฟอกสีที่ได้รับจากนั้นเราคำนวณ D โดยใช้รัศมีการฟอกสีที่ระบุและครึ่งชีวิตการฟื้นตัวที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ในสมการของ Kang และคณะ5 35 แสดง
ตัวแปรซิสเทอีนเดี่ยวของ αS ถูกสังเคราะห์ด้วย 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) ที่ตำแหน่ง 24 (TEMPOL-24-αS) และ 122 (TEMPOL-122-αS) ตามลำดับการติดฉลากแบบหมุน สำหรับการทดลอง EPR ความเข้มข้น αS ถูกตั้งค่าไว้ที่ 100 μM และความเข้มข้น PEG คือ 15% (w/v)สำหรับเงื่อนไขการรวมกลุ่มต่างๆ อัตราส่วน αS:pLK คือ 1:10 ในขณะที่อัตราส่วน αS:ΔNt-Tau และ αS:Tau441 ถูกคงไว้ที่ 1:1สำหรับการทดลองไทเทรตแบบจับกันในกรณีที่ไม่มีความหนาแน่น TEMPOL-122-αS จะถูกคงไว้ที่ 50 ไมโครโมลาร์ และโพลีแคตชันถูกไทเทรตที่ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้น โดยเตรียมแต่ละสภาวะแยกกันการวัด CW-EPR ดำเนินการโดยใช้สเปกโตรมิเตอร์ X-band ของ Bruker ELEXSYS E580 ที่ติดตั้งเครื่องสะท้อนเสียง Bruker ER4118 SPT-N1 ที่ทำงานที่ความถี่ไมโครเวฟ (SHF) ที่ ~9.7 GHzอุณหภูมิถูกตั้งไว้ที่ 25°C และควบคุมโดยเครื่องแช่แข็งไนโตรเจนเหลวได้รับสเปกตรัมภายใต้สภาวะไม่อิ่มตัวที่กำลัง MW 4 mW, แอมพลิจูดมอดูเลชั่น 0.1 mT และความถี่มอดูเลชั่น 100 kHzความเข้มของสเปกตรัมถูกทำให้เป็นมาตรฐานเพื่อหลีกเลี่ยงความแตกต่างในความเข้มข้นของการหมุนระหว่างตัวอย่างและการลดการหมุนที่เป็นไปได้เนื่องจากความเข้มข้นที่ตกค้างของสารรีดิวซ์ในตัวอย่างที่มี Tau441 หรือ ΔNt-Tau (มีอยู่ในสารละลายโปรตีนดั้งเดิม)ค่า g ที่กำหนดได้มาจากการสร้างแบบจำลองสเปกตรัม EPR ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) ที่ใช้งานใน Matlab®67แบบจำลองไอโซโทรปิกองค์ประกอบหนึ่ง/สองชิ้นถูกใช้เพื่อจำลองข้อมูลหลังจากทำให้สัญญาณทั้งหมดเป็นมาตรฐานแล้ว สิ่งตกค้างจะถูกคำนวณโดยการลบการจำลองแต่ละรายการออกจากสเปกตรัมการทดลองที่สอดคล้องกันสำหรับการวิเคราะห์การไทเทรตแบบจับ ความเข้มสัมพัทธ์ของแถบที่สามกับแถบที่สองของสเปกตรัม EPR ที่ทำให้เป็นมาตรฐาน (IIII/III) ถูกนำมาใช้เพื่อติดตามการจับของโพลีแคตเตชันกับ αSเพื่อประมาณค่าคงที่การแยกตัว (Kd) เส้นโค้งผลลัพธ์ถูกปรับเข้ากับแบบจำลองโดยประมาณโดยสมมุติตำแหน่งการจับที่เหมือนกันและเป็นอิสระ
การทดลองสเปกโทรสโกปี NMR ดำเนินการโดยใช้สเปกโตรมิเตอร์ NMR ของ Bruker Neo 800 MHz (1H) ที่ติดตั้งไครโอโพรบและการไล่ระดับ Zการทดลองทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ 130–207 µM αS และเทียบเท่า αS / ΔNt-Tau และ pLK ที่สอดคล้องกันใน 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 และดำเนินการที่ 15°Cเพื่อติดตาม LPS โดย NMR, PEG 10% ถูกเติมไปยังตัวอย่างที่ผสมไว้ล่วงหน้าแผนการก่อกวนการเปลี่ยนแปลงทางเคมี (รูปที่ 1b) แสดงการเปลี่ยนแปลงทางเคมีโดยเฉลี่ย 1H และ 15Nสเปกตรัม αS 2D1H-15N HSQC ถูกกำหนดตามการมอบหมายก่อนหน้า (รายการ BMRB #25227) และยืนยันโดยการบันทึกและการวิเคราะห์สเปกตรัม 3 มิติของ HNCA, HNCO และ CBCAcoNHการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของ13Cαและ13Cβถูกคำนวณเมื่อมีΔNt-Tau หรือ pLK เพื่อวัดการเปลี่ยนแปลงที่เป็นไปได้ในแนวโน้มโครงสร้างรองเมื่อเปรียบเทียบกับการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของαSในรูปแบบคอยล์สุ่มบริสุทธิ์ 68 (รูปที่ 5c เพิ่มเติม)อัตราR1ρถูกวัดโดยการบันทึกการทดลอง hsqctretf3gpsi (ได้มาจากห้องสมุด Bruker) โดยมีความล่าช้า 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 และ 800 ms และฟังก์ชันเลขชี้กำลังถูกปรับเป็นความล่าช้าของความเข้มสูงสุดที่แตกต่างกัน ครั้งเพื่อกำหนด R1ρ และความไม่แน่นอนของการทดลอง
การทดลองด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบแก้ไขเวลาแบบสองสีได้ดำเนินการบนกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลฟลูออเรสเซนซ์แบบแก้ไขเวลา MT200 เชิงพาณิชย์ (PicoQuant, เบอร์ลิน, เยอรมนี) พร้อมด้วยอุปกรณ์นับโฟตอนเดี่ยว (TCSPC) ที่สัมพันธ์กับเวลาหัวเลเซอร์ไดโอดใช้สำหรับการกระตุ้นแบบพัลส์อินเตอร์ลีฟ (PIE) โดยลำแสงจะผ่านท่อนำคลื่นโหมดเดียว และปรับให้เป็นกำลังเลเซอร์ 10 ถึง 100 nW สำหรับเส้นเลเซอร์ 481 นาโนเมตรและ 637 นาโนเมตรที่วัดหลังกระจกไดโครอิกช่วยให้มั่นใจได้ถึงอัตราการนับโฟตอนที่เหมาะสมที่สุด โดยหลีกเลี่ยงผลกระทบของโฟตอนนามแฝง การฟอกสีด้วยแสง และความอิ่มตัวของสีแผ่นปิดหรือแผ่นปิดการสร้างเส้นเลือดใหม่μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, เยอรมนี) ถูกวางโดยตรงในน้ำแช่เหนือเลนส์ Super Apochromat 60x NA 1.2 พร้อมคอแก้ไข (Olympus Life Sciences, Waltham, USA)กระจกไดโครอิก 488/640 นาโนเมตร (เซมร็อค, เลคฟอเรสต์, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) ถูกใช้เป็นตัวแยกลำแสงหลักรังสีที่ไม่ได้โฟกัสจะถูกปิดกั้นด้วยรูที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 50 ไมครอน จากนั้นรังสีที่โฟกัสจะถูกแบ่งออกเป็น 2 เส้นทางการตรวจจับด้วยตัวแยกลำแสง 50/50ใช้ตัวกรองการปล่อย Bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 สำหรับสีย้อมสีเขียว (AF488) และ 690/70 สำหรับสีย้อมสีแดง (Atto647N) ถูกนำมาใช้ที่ด้านหน้าเครื่องตรวจจับไดโอดถล่มโฟตอนเดี่ยว (SPAD) (อุปกรณ์ไมโครโฟตอน, โบลซาโน, อิตาลี) ถูกใช้เป็นเครื่องตรวจจับทั้งการรวบรวมและการวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SymphoTime64 ที่มีวางจำหน่ายทั่วไป (PicoQuant GmbH, เบอร์ลิน, เยอรมนี)
ตัวอย่าง LLPS ห้าสิบไมโครลิตรถูกนำไปใช้กับหลุม μ-Slide การสร้างเส้นเลือดใหม่ (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ประเทศเยอรมนี)รูปภาพที่ได้จะถูกโฟกัสไปที่ 20 µm เหนือก้นหลุมเพื่อระยะการทำงานที่เหมาะสมที่สุดสำหรับหยดแขวนลอย และถึง ~1 µm สำหรับแพและจุดที่มีความละเอียดตามแนวแกนอย่างน้อย 0.25 µm/พิกเซล และมีเวลาหน่วงที่ 400 µs/พิกเซลเลือกข้อมูลโดยการใช้เกณฑ์ความเข้มตามความเข้มของสัญญาณพื้นหลังโดยเฉลี่ย (PBG, ค่าเฉลี่ย + 2σ) สำหรับแต่ละช่องสัญญาณ เพื่อเลือกเฉพาะหยดโปรตีนของเหลว แพ หรือจุด เท่านั้น โดยกรองต้นกำเนิดที่เป็นไปได้ออกจากเฟสที่กระจายตัวออกในการวิเคราะห์อายุขัยของแต่ละสายพันธุ์ ( τ ) ของแต่ละช่อง (สีเขียว " g " สำหรับ AF488 และสีแดง " r " สำหรับ Atto647N) เราเลือกภูมิภาคที่น่าสนใจ (ROI) ที่มีหยด แพ หรือจุด (รูปที่ 1 เพิ่มเติม ).8b) และได้รับพวกมันโดยปรับการสลายตัวตลอดชีวิต (τ D , τ R และ τ P สำหรับหยด แพ หรือจุด ตามลำดับ ดูรูปที่ 8c เพิ่มเติม) ในแต่ละช่องสัญญาณโดยใช้การวิเคราะห์แบบพอดีส่วนท้ายและแบบจำลองการสลายตัวสององค์ประกอบค่าเฉลี่ย τ จาก τ .ROI ที่สร้างโฟตอนน้อยเกินไปสำหรับขนาดแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลหลายตัวจะไม่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ค่าตัดที่ใช้คือ <104 โฟตอนสำหรับแพและจุด และ 103 สำหรับหยดหยดมีเกณฑ์ที่ต่ำกว่าเนื่องจากเป็นเรื่องยากที่จะได้เส้นโค้งการสลายตัวที่มีค่าความเข้มสูงกว่า เนื่องจากหยดในช่องภาพมักจะมีขนาดเล็กกว่าและมีปริมาณน้อยกว่าROI ที่มีจำนวนโฟตอนสูงกว่าขีดจำกัดการสะสมโฟตอน (ตั้งค่าเป็น> 500 จำนวนนับ / พิกเซล) ก็ถูกละทิ้งเพื่อการวิเคราะห์เช่นกันจับคู่กราฟการสลายตัวของความเข้มที่ได้รับจากบริเวณที่สนใจกับความเข้มที่ 90% ของค่าสูงสุด (หลังจากความเข้มสูงสุดของการสลายตัวเล็กน้อย) ตั้งแต่เริ่มต้นอายุการใช้งานเพื่อให้แน่ใจว่ามีการรบกวน IRF น้อยที่สุด ในขณะที่ยังคงรักษาค่าเดิมสำหรับการสลายตัวของความเข้มทั้งหมด การตั้งค่า กรอบเวลาสัมพัทธ์ ได้รับการวิเคราะห์ 25 ถึง 50 ROI สำหรับแพและจุด และ 15-25 ROI สำหรับหยด รูปภาพที่เลือกจากการจำลองมากกว่า 4 รายการบันทึกจากการทดลองอิสระอย่างน้อย 3 ครั้งการทดสอบทีแบบสองด้านถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความแตกต่างทางสถิติระหว่างสปีชีส์หรือระหว่างระบบโคเซอร์เวทสำหรับการวิเคราะห์อายุการใช้งานแบบพิกเซลต่อพิกเซล (τ) จะมีการคำนวณการลดทอนรวมของอายุการใช้งานตลอดสนามสำหรับแต่ละช่องสัญญาณ และดำเนินการประมาณแบบจำลองการลดทอนแบบเอ็กซ์โปเนนเชียล 2/3 องค์ประกอบจากนั้นลดทอนอายุการใช้งานสำหรับแต่ละพิกเซลโดยใช้ค่า τ ที่คำนวณไว้ก่อนหน้านี้ ส่งผลให้ได้ภาพ FLIM แบบหลอกเทียมช่วงอายุการใช้งานของ Tail-Fit จะเท่ากันในทุกภาพในช่องเดียวกัน และการสลายตัวแต่ละครั้งจะทำให้เกิดโฟตอนมากพอที่จะให้ความพอดีที่เชื่อถือได้สำหรับการวิเคราะห์ FRET พิกเซลถูกเลือกโดยการใช้เกณฑ์ความเข้มที่ต่ำกว่าที่ 100 โฟตอน ซึ่งมีค่าเฉลี่ยสัญญาณพื้นหลัง (FBG) ที่ 11 โฟตอนความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ของแต่ละช่องได้รับการแก้ไขโดยปัจจัยการแก้ไขที่กำหนดโดยการทดลอง: 69 crosstalk สเปกตรัม α เท่ากับ 0.004, การกระตุ้นโดยตรง β เท่ากับ 0.0305, ประสิทธิภาพการตรวจจับ γ เท่ากับ 0.517จากนั้นประสิทธิภาพ FRET ที่ระดับพิกเซลจะคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:
โดยที่ FDD คือความเข้มของแสงเรืองแสงที่สังเกตได้ในช่องของผู้บริจาค (สีเขียว) FDA คือความเข้มของแสงเรืองแสงที่สังเกตได้ในช่องของตัวรับ (สีแดง) ภายใต้การกระตุ้นทางอ้อม และ FAA คือความเข้มของแสงเรืองแสงที่สังเกตได้ในช่องของตัวรับ (สีแดง) ภายใต้การกระตุ้นโดยตรง ( พาย).พัลส์ความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์จะสังเกตได้ในช่อง)
วางสารละลายปฏิกิริยา LLPS 100 ไมโครลิตรที่ประกอบด้วย Tau441 โมโนเมอร์ที่ไม่มีป้ายกำกับ 25 µM (โดยมีหรือไม่มี 25 µM αS) ในบัฟเฟอร์ LLPS (เสริมตามด้านบน) บนไมโครเพลท 96 หลุมที่ไม่มีการจับซึ่งมีการเคลือบฟอยล์ด้วยกาวและการเกิดหยดได้รับการตรวจสอบโดยกล้องจุลทรรศน์ WF หลังจาก ความสมดุลภายใน 10 นาทีหลังจากการฟักตัวที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 48 ชั่วโมง พบว่ามีแพโปรตีนและจุดต่างๆ ได้รับการยืนยันจากนั้นค่อย ๆ ขจัดของเหลวบนแพออกจากบ่อ จากนั้นเติมบัฟเฟอร์การแยกตัว 50 ลิตร (HEPES 10 มิลลิโมลาร์ pH 7.4, NaCl 1 โมลาร์, 1 มิลลิโมลาร์ DTT) และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีความเข้มข้นของเกลือที่สูงทำให้แน่ใจได้ว่า LLPS จะไม่เกิดซ้ำเนื่องจาก PEG ตกค้าง และส่วนประกอบโปรตีนที่เป็นไปได้ที่เกิดขึ้นจากปฏิกิริยาระหว่างไฟฟ้าสถิตเพียงอย่างเดียวจะถูกแยกชิ้นส่วนจากนั้นด้านล่างของหลุมจะถูกขูดออกอย่างระมัดระวังด้วยทิปไมโครปิเปต และสารละลายที่ได้จะถูกถ่ายโอนไปยังหลุมสังเกตการณ์ที่ว่างเปล่าหลังจากการฟักตัวอย่างด้วย 50 μM ThT เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จะมีการตรวจสอบการมีอยู่ของจุดที่แยกได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ WFเตรียมไฟบริล αS โซนิกโดยการฟัก 300 µl ของสารละลาย αS 70 µM ใน PBS ที่มีค่า pH 7.4, โซเดียมเอไซด์ 0.01% ที่ 37 °C และ 200 rpm บนเครื่องเขย่าแบบออร์บิทัลเป็นเวลา 7 วันจากนั้นสารละลายถูกปั่นแยกที่ 9600×กรัม เป็นเวลา 30 นาที เม็ดถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS pH 7.4 และโซนิเตต (1 นาที, รอบ 50%, แอมพลิจูด 80% ในตัวอย่างไฟบริลของ Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) ด้วยการกระจายตัวของไฟบริลขนาดเล็กที่มีขนาดค่อนข้างสม่ำเสมอ
การวิเคราะห์ FCS/FCCS และการตรวจจับความบังเอิญสองสี (TCCD) ดำเนินการบนกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลฟลูออเรสเซนต์แบบแก้ไขเวลา MT200 เดียวกัน (Pico-Quant, เบอร์ลิน, เยอรมนี) ที่ใช้สำหรับการทดลองด้วยกล้องจุลทรรศน์ FLIM-FRET โดยใช้โหมด PIEกำลังเลเซอร์สำหรับการทดลองเหล่านี้ถูกเพิ่มเป็น 6.0 µW (481 nm) และ 6.2 µW (637 nm)การผสมผสานระหว่างพลังเลเซอร์เหล่านี้ได้รับเลือกเพื่อสร้างความสว่างที่ใกล้เคียงกันสำหรับคู่ฟลูออโรฟอร์ที่ใช้ ในขณะเดียวกันก็ได้อัตราการนับที่เหมาะสมที่สุด และหลีกเลี่ยงการฟอกสีด้วยแสงและความอิ่มตัวของสีทั้งการรวบรวมและการวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SymphoTime64 เวอร์ชัน 2.3 ที่มีวางจำหน่ายทั่วไป (PicoQuant, เบอร์ลิน, เยอรมนี)
ตัวอย่างของสารรวมกลุ่ม αS/เทาที่แยกเดี่ยวที่ได้รับโดยใช้ LLPS ถูกเจือจางในบัฟเฟอร์สำหรับแยกออกจนถึงความเข้มข้นโมเลกุลเดี่ยวที่เหมาะสม (โดยทั่วไปคือการเจือจาง 1:500 เนื่องจากสารรวมกลุ่มอยู่ที่ความเข้มข้นต่ำอยู่แล้วเมื่อถูกแยกออกจากตัวอย่างโคเซอร์เวต)ตัวอย่างถูกนำไปใช้กับแผ่นปิดฝาโดยตรง (คอร์นนิ่ง สหรัฐอเมริกา) ที่เคลือบล่วงหน้าด้วยสารละลาย BSA ที่ความเข้มข้น 1 มก./มล.
สำหรับการวิเคราะห์ PIE-smFRET ในช่องสีเขียวและสีแดง เกณฑ์ความเข้มที่ต่ำกว่าของโฟตอนที่ 25 ถูกนำมาใช้เพื่อกรองสัญญาณความเข้มต่ำที่เกิดจากเหตุการณ์ที่เป็นโมโนเมอร์ (โปรดสังเกตว่าโมโนเมอร์มีจำนวนมากกว่าตัวอย่างที่รวมกลุ่มเมื่อเปรียบเทียบกับมวลรวมที่แยกออก)ขีดจำกัดนี้คำนวณเป็นห้าเท่าของความเข้มเฉลี่ยของโมโนเมอร์ αS ที่ได้รับจากการวิเคราะห์ตัวอย่างโมโนเมอร์บริสุทธิ์ เพื่อเลือกมวลรวมสำหรับการวิเคราะห์โดยเฉพาะวงจรขับเคลื่อน PIE ร่วมกับการรับข้อมูลของ TSCPC ช่วยให้สามารถประยุกต์ใช้ตัวกรองการถ่วงน้ำหนักตลอดอายุการใช้งาน ซึ่งจะช่วยขจัดสัญญาณรบกวนในพื้นหลังและสเปกตรัมความเข้มของแสงแฟลร์ที่เลือกโดยใช้เกณฑ์ข้างต้นได้รับการแก้ไขโดยใช้สัญญาณพื้นหลังโดยเฉลี่ยที่กำหนดจากฮิสโตแกรมของการเกิดเทียบกับความเข้ม/ถังของตัวอย่างเฉพาะบัฟเฟอร์การระเบิดที่เกี่ยวข้องกับมวลรวมขนาดใหญ่โดยทั่วไปจะใช้เวลาหลายถังติดต่อกันในการติดตามเวลา (ตั้งค่าเป็น 1 มิลลิวินาที)ในกรณีเหล่านี้ มีการเลือกถังที่มีความแข็งแกร่งสูงสุดสำหรับการวิเคราะห์ FRET และปริมาณสัมพันธ์ จะใช้แฟคเตอร์แกมมาที่กำหนดตามทฤษฎี γ (0.517)การมีส่วนร่วมของสเปกตรัมและการกระตุ้นโดยตรงนั้นไม่มีนัยสำคัญ (พิจารณาจากการทดลอง) ที่กำลังไฟเลเซอร์กระตุ้นที่ใช้ประสิทธิภาพและปริมาณสัมพันธ์ของ FRET ในการระเบิดมีการคำนวณดังนี้