ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 ท่อเชื่อมดูเพล็กซ์สำหรับอุตสาหกรรมเคมี ส่วนประกอบทางเคมี การขาด SPECC1L นำไปสู่ความเสถียรที่เพิ่มขึ้นของข้อต่อที่ประกบกันและลดการไหลของเซลล์ยอดประสาทสมอง

ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comคุณกำลังใช้เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่มีการรองรับ CSS แบบจำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript

ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 ท่อเชื่อมดูเพล็กซ์สำหรับอุตสาหกรรมเคมี

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.เป็นผู้ผลิตชั้นนำที่เชี่ยวชาญด้านท่อสเตนเลสไร้ตะเข็บ, ท่ออบอ่อน, ท่อขดไร้ตะเข็บ ฯลฯเพื่ออำนวยความสะดวกแก่ลูกค้า ทางเราก็ได้เชื่อมท่อและท่อด้วยLiaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.มีอุปกรณ์การผลิตและการทดสอบที่ทันสมัยที่สุดเราสามารถตอบสนองความต้องการของคุณได้โดยสิ้นเชิงตามมาตรฐานอย่างเคร่งครัด ท่อที่เราผลิตจะมีความทนทานต่อ OD และ WT ที่ถูกต้องเสมอการควบคุมความอดทนเป็นไปตามมาตรฐานการผลิตอย่างเคร่งครัดผลิตภัณฑ์ของเราพอใจกับลูกค้าเสมอลูกค้าซื้อผลิตภัณฑ์ของเราสร้างผลกำไรมากขึ้น
ก) OD (เส้นผ่านศูนย์กลางภายนอก) : 3.18 มม. ถึง 101.6 มม
b) WT (ความหนาของผนัง) : 0.5 มม. ถึง 20 มม
c) ความยาว: ตามความต้องการของลูกค้า
ง) มาตรฐาน : ASTM A312;มาตรฐาน ASTM A269;มาตรฐาน ASTM A789;ASTM A790 ฯลฯ
จ) วิธีการประมวลผล: ERW, EFW เป็นต้น

แถบเลื่อนแสดงสามบทความต่อสไลด์ใช้ปุ่มย้อนกลับและปุ่มถัดไปเพื่อเลื่อนไปตามสไลด์ หรือใช้ปุ่มตัวควบคุมสไลด์ที่ส่วนท้ายเพื่อเลื่อนไปตามแต่ละสไลด์
เซลล์ยอดประสาทสมอง (CNCC) จะลอกรอยพับของเส้นประสาทของตัวอ่อนออกและย้ายไปยังส่วนโค้งของคอหอย ซึ่งก่อตัวเป็นโครงสร้างส่วนกลางของใบหน้าส่วนใหญ่ความผิดปกติของ CNCC มีบทบาทสำคัญในสาเหตุของภาวะปากแหว่งเพดานโหว่ ซึ่งเป็นความผิดปกติแต่กำเนิดที่พบบ่อยพบการกลายพันธุ์ของ Heterozygous SPECC1L ในผู้ป่วยที่มีรอยแหว่งผิดปรกติและเป็นกลุ่มอาการที่นี่เรารายงานการย้อมสีที่เพิ่มขึ้นของส่วนประกอบ Canonical Glue Junction (AJ), β-catenin และ E-cadherin ในเซลล์ล้มลง SPECC1L ที่เพาะเลี้ยง และไมโครกราฟอิเล็กตรอนแสดงการแพร่กระจายของปลายยอดของ AJเพื่อให้เข้าใจถึงบทบาทของ SPECC1L ใน morphogenesis ของ craniofacial เราได้สร้างแบบจำลองเมาส์ที่บกพร่อง Specc1lการกลายพันธุ์แบบ Homozygous เป็นอันตรายถึงชีวิตจากตัวอ่อนและแสดงการปิดท่อประสาทที่บกพร่องและการเคลือบ CNCCการย้อมสีโปรตีน AJ จะเพิ่มขึ้นในรอยพับของระบบประสาทกลายพันธุ์ข้อบกพร่อง AJ นี้สอดคล้องกับข้อบกพร่องในการแยกชั้นของ CNCC ซึ่งต้องมีการละลายของ AJนอกจากนี้การกลายพันธุ์ของ Specc11 ยังลดการส่งสัญญาณ PI3K-AKT และเพิ่มการตายของเซลล์ในหลอดทดลอง การยับยั้งเล็กน้อยของการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ในเซลล์ประเภทไวด์ก็เพียงพอที่จะกระตุ้นการเปลี่ยนแปลง AJที่สำคัญการเปลี่ยนแปลง AJ ที่เกิดจากการล้มลงของ SPECC1L สามารถย้อนกลับได้โดยการเปิดใช้งานเส้นทาง PI3K-AKTเมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า SPECC1L ซึ่งเป็นตัวควบคุมใหม่ของสัญญาณ PI3K-AKT และชีววิทยา AJ เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการปิดท่อประสาทและการแบ่งชั้น CNCC
เซลล์ยอดประสาทสมอง (CNCC) จำกัดตำแหน่งอยู่ที่ neuroectoderm ด้านหลัง และแยกออกจากนิวโรเอพิเธเลียมของรอยพับของระบบประสาทที่กำลังพัฒนา โดยผ่านกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนผ่านของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์ (EMT)1,2,3การโยกย้าย CNCCs ของเยื่อบุผิวล่วงหน้าจะขัดขวางการเชื่อมต่อระหว่างเซลล์และกลายเป็นการโยกย้าย CNCCs แบบมีเซนไคมอลที่เติมเต็มส่วนโค้งของคอหอยที่หนึ่งและสองและสร้างกระดูกอ่อนกะโหลกศีรษะส่วนใหญ่ดังนั้น ยีนที่ควบคุมการทำงานของ CNCC มักจะหยุดชะงักในสาเหตุของความผิดปกติแต่กำเนิดของกะโหลกศีรษะและใบหน้า เช่น รอยแหว่งของช่องปาก ซึ่งส่วนใหญ่ส่งผลกระทบต่อการเกิด 1/800 คนในสหรัฐอเมริกาเพียงแห่งเดียว8.ความพิการแต่กำเนิดอย่างหนึ่ง
การแยกชั้นของ CNCC เกิดขึ้นพร้อมกับการปิดท่อประสาทส่วนหน้าระหว่าง 8.5 ถึง 9.5 วันของการพัฒนาของตัวอ่อนในหนูการกลายพันธุ์ของยีนที่เกี่ยวข้องกับรอยแหว่งของช่องปากและใบหน้าของเมาส์จำนวนหนึ่งยังแสดงรูปแบบของข้อบกพร่องของท่อประสาทบางรูปแบบ รวมถึง Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 และ Pdgfrα12อย่างไรก็ตาม กระบวนการของการปิดท่อประสาทและการแบ่งชั้น CNCC นั้นถือได้ว่าเป็นอิสระ เนื่องจากเมาส์กลายพันธุ์ Splotch (Pax3) แสดงข้อบกพร่องในการปิดท่อประสาทโดยไม่มีผลกระทบใด ๆ ต่อการแบ่งชั้นหรือการย้ายของ CNCCโมเดลเมาส์เพิ่มเติมที่มีข้อบกพร่องในการผ่า CNCC และการปิดท่อประสาทจะช่วยแยกแยะพื้นฐานระดับโมเลกุลทั่วไปของกระบวนการทั้งสองนี้
การแยก CNCC ออกจากเซลล์ประสาทจำเป็นต้องละลายจุดเชื่อมต่อกาว (AJs) ซึ่งประกอบด้วยโปรตีนเชิงซ้อนที่ประกอบด้วย E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin และ α-actinin ที่เกี่ยวข้องกับเส้นใยแอคติน 2 การศึกษาการแสดงออกมากเกินไป E-cadherin ในรอยพับประสาทแสดงให้เห็นว่าการลดลงหรือความล่าช้าในการแยกตัวของ CNCCในทางกลับกัน การปราบปราม E-cadherin ส่งผลให้เกิดการแบ่งชั้นในช่วงต้นปัจจัยหลายประการที่เป็นสื่อกลางของ EMT ในระหว่างการแบ่งชั้นของ CNCC คือปัจจัยการถอดรหัส (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) และการเปลี่ยนแปลงโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) เช่น เมทริกซ์ metalloproteinases (MMPs) อย่างไรก็ตาม CNCC เป็นตัวควบคุม AJ ของ cytoskeletal โดยตรง ยังไม่ทราบวิถีทางของ PI3K-AKT เป็นที่รู้กันว่าเป็นปฏิปักษ์กับระดับ E-cadherin ซึ่งส่วนใหญ่มาจากการวิจัยโรคมะเร็งการศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าการสูญเสียการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ที่ใช้ PDGFα ในหนูนำไปสู่ความผิดปกติของกะโหลกศีรษะและใบหน้า รวมถึงเพดานโหว่และข้อบกพร่องของท่อประสาทอย่างไรก็ตามความสัมพันธ์ระหว่างเส้นทาง PI3K-AKT และความเสถียรของ AJ ต่อการแบ่งชั้น CNCC นั้นไม่ชัดเจน
ก่อนหน้านี้เราระบุว่า SPECC1L เป็นยีนกลายพันธุ์ตัวแรกในคนสองคนที่มีรอยแหว่งอย่างรุนแรงที่ขยายจากปากถึงตา หรือที่เรียกว่าแหว่งเฉียง (ObFC) หรือแหว่ง Tessier IV18การกลายพันธุ์ของ SPECC1L ได้รับการระบุในสองตระกูลหลายชั่วอายุคนที่มีกลุ่มอาการ Opitz G / BBB ที่โดดเด่นแบบออโตโซม (OMIM # 145410) ซึ่งบุคคลที่ได้รับผลกระทบแสดงอาการ Hyperdistance และปากแหว่งเพดานโหว่ / เพดานปาก และในครอบครัวหนึ่งที่มีกลุ่มอาการ Tibi overdistance ( OMIM # 145420) 20 .มากกว่าครึ่งหนึ่งของผู้ป่วยกลุ่มอาการ Opitz G/BBB มีการเชื่อมโยงแบบ X (OMIM #300000) และเกิดจากการกลายพันธุ์ในยีน MID1 ซึ่งเข้ารหัสโปรตีน 22 ของโครงกระดูกเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับไมโครทูบูลเราตั้งสมมติฐานว่า SPECC1L ซึ่งเป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ microtubules และโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างของเซลล์แอกตินอาจเป็นสื่อกลางในการส่งสัญญาณที่จำเป็นสำหรับการเปลี่ยนแปลงโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างของเซลล์จากการศึกษา ในหลอดทดลอง และ ในสัตว์ทดลอง ตอนนี้เราได้อธิบาย SPECC1L ว่าเป็นตัวควบคุมใหม่ของความเสถียรของ AJ ผ่านการส่งสัญญาณ PI3K-AKTในระดับเซลล์ การขาด SPECC1L ส่งผลให้ระดับโปรตีน pan-AKT ลดลง และการเพิ่มขึ้นของการกระจายตัวของปลายยอดของ AJ ซึ่งถูกกำจัดโดยการกระตุ้นทางเคมีของทางเดิน AKTในร่างกาย ตัวอ่อนที่ขาด Specc11 แสดงการปิดท่อประสาทที่บกพร่องและการแยก CNCC ที่ลดลงดังนั้น SPECC1L จึงทำหน้าที่ในการส่งสัญญาณตามการยึดเกาะของเซลล์ที่มีการควบคุมอย่างเข้มงวด ซึ่งจำเป็นสำหรับฟังก์ชัน CNCC ปกติในระหว่างการสร้างรูปร่างของใบหน้า
เพื่ออธิบายลักษณะของบทบาทของ SPECC1L ในระดับเซลล์ เราใช้เซลล์ Osteosarcoma ที่เสถียรที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ U2OS ที่ขาดใน SPECC1L18เซลล์ U2OS ที่เสถียรเหล่านี้ซึ่งมีการล้มลงของ SPECC1L (kd) มีระดับการถอดเสียงและโปรตีน SPECC1L ลดลงปานกลาง (60–70%) พร้อมด้วยข้อบกพร่องในการย้ายถิ่นและการปรับโครงสร้างโครงสร้างของโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างใหม่ของโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างใหม่ของโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างใหม่ที่เซลล์ของ actin cytoskeleton 18 SPECC1L แสดงให้เห็นว่านำไปสู่ข้อบกพร่องแบบไมโทติส 23จากลักษณะเฉพาะเพิ่มเติม เราพบว่าเซลล์ SPECC1L-kd ที่เสถียรของเราเปลี่ยนสัณฐานวิทยาในระดับการบรรจบกันที่สูงมาก (รูปที่ 1)เซลล์ควบคุมแต่ละเซลล์และเซลล์ kd ที่จุดบรรจบกันต่ำดูคล้ายกัน (รูปที่ 1A,D)24 ชั่วโมงหลังฟิวชั่น เซลล์ควบคุมยังคงรูปร่างทรงลูกบาศก์ไว้ (รูปที่ 1B, E) ในขณะที่เซลล์ SPECC1L-kd ยืดออก (รูปที่ 1C, F)ขอบเขตของการเปลี่ยนแปลงในรูปร่างของเซลล์นี้ถูกจับได้โดยการถ่ายภาพสด ในสิ่งมีชีวิต ของเซลล์ควบคุมและเซลล์ kd (ภาพยนตร์ 1)เพื่อกำหนดบทบาทของ SPECC1L ในเซลล์ที่ไหลมารวมกัน เราได้ตรวจสอบการแสดงออกของมันก่อนเราพบว่าระดับโปรตีน SPECC1L เพิ่มขึ้นเมื่อฟิวชั่น (รูปที่ 1G) ในขณะที่ระดับการถอดเสียง SPECC1L ไม่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 1H)นอกจากนี้เมื่อความหนาแน่นของเซลล์เพิ่มขึ้น โปรตีน SPECC1L จะสะสมที่ขอบเขตระหว่างเซลล์ (รูปที่ 2A-E) โดยมีรูปแบบทับซ้อนกับ β-catenin ที่เกี่ยวข้องกับเมมเบรน (รูปที่ 2A'-E')เมื่อพิจารณาถึงความสัมพันธ์ของ SPECC1L กับโครงร่างโครงร่างโครงร่างของเซลล์แอกติน 18,23 เราตั้งสมมติฐานว่า SPECC1L โต้ตอบกับรอยต่อกาวแบบแอกติน (AJ)
(AF) เซลล์น็อคดาวน์ SPECC1L (DF) จะยืดออกที่จุดบรรจบกันสูง (F) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม U2OS (AC)ที่แสดงไว้ที่นี่เป็นจุดเวลาสามจุดจากทั้งหมดหกจุด (T1, T3, T6) ที่เราเลือกสำหรับความหนาแน่นของเซลล์ที่แตกต่างกัน(G) การวิเคราะห์ Western blot แสดงให้เห็นว่าโปรตีน SPECC1L มีความเสถียรที่ระดับการบรรจบกันในระดับสูงเมื่อเปรียบเทียบกับการบรรจบกันระดับต่ำในเซลล์ควบคุมWestern blot ของ SPECC1L แสดงแถบความถี่ 120 kDa ที่คาดหวังและแถบน้ำหนักโมเลกุลที่สูงกว่า ซึ่งอาจได้รับการแก้ไขหลังการแปล (*)การวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกันสำหรับการบรรจบกันต่ำและสูงรูปภาพที่แสดง SPECC1L ที่จุดบรรจบกันต่ำและสูงถูกนำมาจากจุดเดียวกันรอยเปื้อนเดียวกันถูกเอาออกและตรวจสอบอีกครั้งด้วยแอนติบอดี β-แอคติน(H) การวิเคราะห์ RT-PCR เชิงปริมาณแสดงให้เห็นว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในระดับการถอดเสียง SPECC1Lแถบข้อผิดพลาดแสดงถึง SEM จากการทดลองอิสระสี่ครั้ง
(AE) เราเลือกจุดเวลาหกจุด (T1-T6) ซึ่งเป็นตัวแทนของช่วงความหนาแน่นของเซลล์เพื่อทำให้การวิเคราะห์รูปร่างของเซลล์เป็นปกติและการเปลี่ยนแปลง AJ ในเซลล์ U2OS ด้วยการล้มลงของ SPECC1L (kd)ห้าจุดแรกของเวลาเหล่านี้รวมถึงเซลล์เดี่ยว (T1), การหลอมรวมของกลุ่มเซลล์ขนาดเล็ก (T2), การหลอมรวมโดยไม่มีการปรับรูปร่างเซลล์ kd ใหม่ (T3), การปรับรูปร่างเซลล์ kd ใหม่ (T4) และการเปลี่ยนแปลง 24 ชั่วโมงในรูปแบบหลังของเซลล์ kd (T5)โปรตีน SPECC1L ส่วนใหญ่กระจายอยู่ในไซโตพลาสซึมที่ T1 (A) แต่สังเกตการสะสมที่ขอบเขตระหว่างเซลล์ ณ จุดเวลาต่อมา (B-E, ลูกศร)(FJ) β-catenin แสดงการสะสมที่คล้ายกันที่ขอบเขตระหว่างเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับ AJ คอมเพล็กซ์(A'-E') SPECC1L และ β-catenin แสดงการย้อมสีที่ทับซ้อนกันที่ขอบเซลล์ที่ความหนาแน่นของเซลล์สูง (ลูกศร)(F'-J') ในเซลล์ SPECC1L-kd การย้อมสี cat-catenin จะปรากฏเป็นปกติที่ความหนาแน่นของเซลล์ต่ำ (F'-H') แต่จะขยายเมื่อรูปร่างของเซลล์เปลี่ยนแปลง (I ', J'; ลูกศร) บ่งชี้ว่า AJ มีการเปลี่ยนแปลงแท่ง = 10 µm
จากนั้นเราพยายามตรวจสอบผลกระทบของการขาด SPECC1L ต่อ AJเราใช้เครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับ AJ หลายตัว รวมถึงส่วนประกอบที่เป็นที่ยอมรับ F-actin, myosin IIb, β-catenin และ E-cadherinเส้นใยความเครียดของ Actin เพิ่มขึ้นในเซลล์ SPECC1L-kd ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (รูปที่ 3A, B) 18Myosin IIb ที่เกี่ยวข้องกับเส้นใยแอคตินแสดงให้เห็นว่าเซลล์ SPECC1L-kd ในหลอดทดลอง เพิ่มขึ้นคล้ายกัน (รูปที่ 3C, D)β-catenin ที่เกี่ยวข้องกับ AJ จับกับ Cadherin ที่เยื่อหุ้มเซลล์โดยแสดงรูปแบบการแสดงออก "รังผึ้ง" ปกติในเซลล์ควบคุม (รูปที่ 3E, G)สิ่งที่น่าสนใจคือในภาพแบนโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล β-catenin (รูปที่ 3E, F) และ E-cadherin (รูปที่ 3G, H) การย้อมสีบนเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่ขาด SPECC1L ที่ไหลมารวมกันแสดงรูปแบบที่โดดเด่นของการย้อมสีแบบขยายการขยายตัวของการย้อมสี cat-catenin ที่เกี่ยวข้องกับ AJ ในเซลล์ kd นี้เด่นชัดที่สุดที่จุดบรรจบกัน แต่ดูเหมือนว่าจะนำหน้าการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ (รูปที่ 2F-J, F'-J ')เพื่อตรวจสอบลักษณะทางกายภาพของการย้อมสี AJ แบบขยายนี้ เราได้ตรวจสอบเส้นขอบของเซลล์บนพื้นผิวปลายยอดของเซลล์ SPECC1L-kd U2OS โดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) (รูปที่ 3I, J)ตรงกันข้ามกับเซลล์ควบคุม (รูปที่ 3I) ซึ่งมีบริเวณที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่นแยกจากกันซึ่งบ่งบอกถึง AJ (ลูกศร) เซลล์ kd (รูปที่ 3J) แสดงให้เห็นพื้นที่ขนาดใหญ่ที่ต่อเนื่องกันของความหนาแน่นของอิเล็กตรอนสูงซึ่งบ่งบอกถึง AJ ตามระนาบ apicobasal.นอกจากนี้ในส่วนตามขวาง เราสังเกตเห็นการพับของเยื่อหุ้มเซลล์อย่างกว้างขวางในเซลล์ kd (รูปที่ S1A, B) ซึ่งอธิบายรูปแบบเพิ่มเติมของแถบการย้อมสี cat-catenin และ E-cadherin (รูปที่ 3F, H)เพื่อสนับสนุนบทบาทของ SPECC1L ใน AJs β-catenin ได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันร่วมกับ SPECC1L ใน lysates ของเซลล์ U2OS ที่ไหลมารวมกัน (รูปที่ 3K)นอกเหนือจากการขยายภูมิคุ้มกันสำหรับเครื่องหมาย AJ แล้ว การวิเคราะห์ TEM ยังสอดคล้องกับสมมติฐานของเราที่ว่าการขาด SPECC1L จะเพิ่มความหนาแน่นและความแปรปรวนของ AJ apical-basal
(AH) เพิ่มการย้อมสี F-actin ในเซลล์ kd ที่ 48 ชั่วโมงหลังฟิวชั่น (T6; A, B)การเปลี่ยนแปลงการย้อมสีของ myosin IIb ที่เกี่ยวข้องกับ F-actin (C, D)รูปแบบที่ราบรื่นของการย้อมสีเมมเบรน cat-catenin และ E-cadherin ในเซลล์ควบคุม (E, G) ได้รับการปรับปรุงในเซลล์ SPECC1L-kd (F, H)แท่ง = 10 µm(I – J) micrographs ของอิเล็กตรอนที่สังเกตรอยต่อระหว่างเซลล์ยอด - ฐานเซลล์ควบคุมแสดงบริเวณที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่นชัดเจนซึ่งบ่งชี้ถึงทางแยกที่เหนียว (I, ลูกศร)ในทางตรงกันข้ามทางแยกปลายยอดทั้งหมดในเซลล์ SPECC1L-kd ปรากฏว่ามีอิเล็กตรอนหนาแน่น (J, ลูกศร) ซึ่งบ่งบอกถึงความหนาแน่นที่เพิ่มขึ้นและการกระจายตัวของทางแยกกาว( K ) β-catenin ได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันร่วมกับ SPECC1L ในเซลล์ lysates ที่ไหลมารวมกันภาพที่ถ่ายจากจุดหนึ่งซึ่งแสดงถึงหนึ่งในสี่การทดลองอิสระ
เพื่อทำความเข้าใจบทบาทของ SPECC1L ใน morphogenesis ของ craniofacial เราได้สร้างแบบจำลองเมาส์ที่บกพร่อง Specc1l โดยใช้เซลล์ดัก ES อิสระสองเส้น DTM096 และ RRH048 (BayGenomics, CA) ซึ่งเป็นตัวแทนของ intron 1 และ Specc1l transcripts ถูกจับที่ 15 ( รูปที่ 1) .4A รูปที่ S2)ตำแหน่งจีโนมของส่วนแทรกเวกเตอร์ล่อถูกกำหนดโดยการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดและยืนยันโดย PCR (รูปที่ S2)การออกแบบกับดักยีนทั้งสองยังอนุญาตให้มีการรวมตัวของนักข่าว Specc11-lacZ ในเฟรมเมื่อจับภาพดังนั้นการแสดงออกของ lacZ ที่กำหนดโดยการย้อมสี X-gal จึงถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้การแสดงออกของ Specc11อัลลีลทั้งสองแสดงรูปแบบการแสดงออกของ lacZ ที่คล้ายกัน โดยกับดักยีน DTM096 ในอินตรอน 1 แสดงการแสดงออกที่แข็งแกร่งกว่า RRH048 ในอินตรอน 15 (ไม่แสดง)อย่างไรก็ตาม Specc1l มีการแสดงออกอย่างกว้างขวาง โดยมีการแสดงออกที่แข็งแกร่งโดยเฉพาะอย่างยิ่งในรอยพับของระบบประสาทที่ E8.5 (รูปที่ 4B) ในท่อประสาทและกระบวนการใบหน้าที่ E9.5 และ E10.5 (รูปที่ 4C, D) และในการพัฒนาแขนขา ที่ E105 และดวงตา (รูปที่ 4D)ก่อนหน้านี้เรารายงานว่าการแสดงออกของ SPECC1L ในส่วนโค้งแรกของคอหอยที่ E10.5 มีอยู่ในเยื่อบุผิวและ mesenchyme พื้นฐาน ซึ่งสอดคล้องกับเชื้อสาย CNCCเพื่อทดสอบการแสดงออกของ SPECC1L ใน CNCC เราได้ดำเนินการพับประสาท E8.5 (รูปที่ 4E-J) และส่วนกะโหลกศีรษะ E9.5 (รูปที่ 4K-)ที่ E8.5 ระบบประสาทย้อมสี SPECC1L จะพับอย่างเข้มข้น (รูปที่ 4E, H) รวมถึงเซลล์ที่ย้อมด้วยเครื่องหมาย NCC (รูปที่ 4G, J)ที่ E9.5, SPECC1L (รูปที่ 4K, N) มีการย้อมสีอย่างมากจากการโยกย้าย CNCC ที่ย้อมร่วมกับ AP2A (รูปที่ 4L, M) หรือ SOX10 (รูปที่ 4O, P)
( A ) การแสดงแผนผังของยีน Specc11 ของเมาส์ที่แสดงการแทรกเวกเตอร์ล่อในโคลนเซลล์ ES DTM096 (อินตรอน 1) และ RRH048 (อินตรอน 15)(BD) การย้อมสี lacZ ของตัวอ่อน Specc1lDTM096 แบบเฮเทอโรไซกัสซึ่งเป็นตัวแทนของการแสดงออกของ Specc1l จาก E8.5 ถึง E10.5NE = neuroectoderm, NF = neural fold, PA1 = ส่วนโค้งของคอหอยแรก(EP) การสร้างภูมิคุ้มกัน SPECC1L ด้วยเครื่องหมาย NCC AP2A และ SOX10 ใน E8.5 (NF; EJ) รอยพับของระบบประสาทและส่วนกะโหลกศีรษะ E9.5 (KP)การย้อมสี SPECC1L ถูกสังเกตอย่างกว้างขวางในรอยพับของระบบประสาท E8.5 (E, H; หัวลูกศร) รวมถึงเซลล์ที่มีป้ายกำกับด้วย AP2A (F, G; หัวลูกศร) และ SOX10 (I, J; หัวลูกศร)ที่ E9.5, SPECC1L มีการย้อมสีอย่างมากในการโยกย้าย CNCCs (K, N; ลูกศร) ที่มีป้ายกำกับ AP2A (L, M; ลูกศร) และ SOX10 (O, P; ลูกศร)
การข้ามระหว่างหนู Specc1lDTM096/+ และ Specc1lRRH048/+ แบบเฮเทอโรไซกัสแสดงให้เห็นว่าอัลลีลกับดักยีนสองตัวนั้นไม่ได้ประกอบกัน และสารประกอบเฮเทอโรไซโกต์และโฮโมไซโกต์ของตัวอ่อนสำหรับอัลลีลกับดักยีนตัวใดตัวหนึ่งนั้นทำให้ตัวอ่อนตายได้ (ตาราง S1)อัตราส่วนเมนเดลเลียนบ่งชี้การลดลงของอัตราการรอดชีวิตของเฮเทอโรไซโกตตั้งแต่แรกเกิด (คาดไว้ 1.34 เทียบกับ 2.0)เราสังเกตเห็นอัตราการเสียชีวิตปริกำเนิดต่ำในกลุ่มเฮเทอโรไซโกต บางคนมีความผิดปกติของกะโหลกศีรษะใบหน้า (รูปที่ S3)อย่างไรก็ตาม การแทรกซึมของฟีโนไทป์ของกะโหลกศีรษะและใบหน้าปริกำเนิดที่ต่ำทำให้ยากต่อการศึกษากลไกทางพยาธิสรีรวิทยาที่ซ่อนอยู่ดังนั้นเราจึงมุ่งเน้นไปที่ฟีโนไทป์ของตัวอ่อนที่ทำให้ตายได้ของการกลายพันธุ์ Specc11 แบบโฮโมไซกัส
สารประกอบเฮเทอโรไซกัสหรือโฮโมไซกัส Specc1lDTM096/RRH048 เอ็มบริโอกลายพันธุ์ส่วนใหญ่ไม่ได้พัฒนาหลังจาก E9.5–10.5 (รูปที่ 5A–D) และท่อประสาทไม่ได้ปิดด้านหน้า (รูปที่ 5B, D) และบางครั้งก็ปิดด้านหลัง (ไม่แสดง) ..ข้อบกพร่องการปิดท่อประสาทสมองนี้สัมพันธ์กับ CNCC ส่วนใหญ่ที่มีเครื่องหมาย DLX2 ซึ่งยังคงอยู่ในรอยพับประสาทที่ E10.5 ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีการผ่า (รูปที่ 5A'-D')เพื่อตรวจสอบว่าขนาดโดยรวมของ CNCC ลดลงหรือไม่ เราได้ติดแท็กบรรทัด CNCC ด้วย GFP ในสายกับดักยีนของเราด้วย Wnt1-Cre และ ROSAmTmGเราสตรีมการจัดเรียง GFP+ NCC และ GFP- (RFP+) ที่ไม่ใช่ NCC จากตัวอ่อนทั้งหมดที่ E9.5 สัดส่วนของ CNCC ที่ติดป้ายกำกับ GFP ที่เรียงลำดับการไหลไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง WT และเอ็มบริโอกลายพันธุ์ (ไม่แสดง) ซึ่งบ่งบอกถึงข้อกำหนด CNCC ปกติดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าการย้อมสี Wnt1-Cre และ DLX2 ที่เหลือในรอยพับของระบบประสาทที่สัมผัส (รูปที่ 5B ') เกิดจากการชั้น CNCC ที่มีข้อบกพร่องซึ่งอาจเกิดจากความหนาแน่นหรือการกระจายตัวของเซลล์ AJ ที่เพิ่มขึ้นดังที่เห็นในเซลล์ SPECC1L-kdเราใช้เครื่องหมาย NCC SOX10, AP2A และ DLX2 เพื่อยืนยันการมีอยู่ของ CNCC ในรอยพับประสาท (รูปที่ 5E-R)ที่ E8.5 การย้อมสีรอยพับของระบบประสาทสำหรับเครื่องหมาย NCC ทั้งสามตัวถูกสังเกตในส่วนของ WT (รูปที่ 5E, G, I) และการกลายพันธุ์ Specc1l (รูปที่ 5F, H, J)ที่ E9.5 ในขณะที่เครื่องหมาย NCC เปื้อนการโยกย้าย NCC ในส่วน WT (รูปที่ 5M, O, Q) การย้อมสี NCC ที่เหลือนั้นถูกพบในพับประสาทสัมผัสของตัวอ่อนกลายพันธุ์ Specc1l (รูปที่ 5N, P, R)เนื่องจาก SOX10 และ DLX2 ทำเครื่องหมายว่ากำลังย้าย CNCC ผลลัพธ์นี้ชี้ให้เห็นว่า CNCC ที่ขาด SPECC1L บรรลุข้อกำหนดหลังการโยกย้าย แต่ล้มเหลวในการโยกย้ายจากรอยพับของระบบประสาท
การขาด Specc11 นำไปสู่การปิดท่อประสาทที่มีข้อบกพร่อง การแยกเซลล์ยอดประสาทสมองและ AJ
(A, B') E9.5 WT (A) เอ็มบริโอบรรทุกเซลล์ยอดประสาทสมองที่กำลังย้าย (CNCC) ที่มีป้ายกำกับ Wnt1-Cre (A')ในทางตรงกันข้าม เอ็มบริโอกลายพันธุ์ Specc11 แสดงพับประสาทเปิด (B) หัวลูกศร) และ CNCCs ที่ยังไม่ได้ย้าย (B ', หัวลูกศร)(C, D') ภาพสนามที่สว่าง (C, D') และการสร้างภูมิคุ้มกัน (C', D') ของเครื่องหมาย CNCC DLX2 ของตัวอ่อน E10.5 WT (C, C') และ Specc1l (D, D')ในเอ็มบริโอ WT E10.5, CNCC ที่ให้ผลบวกของ DLX2 ตั้งอาณานิคมส่วนโค้งของเหงือก (C', ลูกศร) ในขณะที่อยู่ในการกลายพันธุ์ การย้อมสีที่เห็นได้ชัดเจนยังคงอยู่ในรอยพับของประสาทแบบเปิด (D', ลูกศร) และในส่วนโค้งของคอหอยแรก (D', ลูกศร)) โดยมีการย้อมสี (ลูกศร) บ่งชี้ถึงการแยกส่วนและการโยกย้ายที่ไม่ดีของ CNCCER) ส่วนของเอ็มบริโอกลายพันธุ์ WT และ Specc1l ในระยะ E8.5 (E–L) และ E9.5 (M–R) มีป้ายกำกับด้วยเครื่องหมาย NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) และ DLX2 (I, J, Q, R)ที่ E8.5 มีการสังเกตการย้อมสี NCC ในส่วนของรอยพับของประสาทชนิดไวด์ (NF) และส่วนกลายพันธุ์การย้อมสีร่วมของ SOX10 และ β-catenin ใน E8.5 WT (K) และกลายพันธุ์ (L) เผยให้เห็นการย้อมสี β-catenin เพิ่มขึ้นที่ขอบเขตของเซลล์ในรอยพับของระบบประสาทที่ E9.5 พบว่ามีการย้อมสีแบบไวด์ของการย้าย CNCCs (M, O, Q) ในขณะที่อยู่ในการกลายพันธุ์ CNCCs ที่ไม่แบ่งชั้นจะย้อมรอยพับของระบบประสาทแบบเปิด (N, P, R)(S – Z) การวิเคราะห์การติดฉลาก In vivo AJ ในส่วนโคโรนาของ WT และ Specc11DTM096 / RRH048 ตัวอ่อนที่มีการกลายพันธุ์ E9.5ระนาบหน้าตัดโดยประมาณจะแสดงอยู่ที่มุมขวาบนในส่วนของเนื้อเยื่อกลายพันธุ์พบว่ามีการย้อมสี F-actin (S, T) และ myosin IIb (U, V) เพิ่มขึ้นเช่นเดียวกับผลลัพธ์ ในหลอดทดลอง ในรูปที่ 3 ในเอ็มบริโอกลายพันธุ์ พบว่าการย้อมสีเมมเบรนที่ได้รับการปรับปรุงสำหรับ β-catenin (W, X) และ E-cadherin (Y, Z)(AA-BB) ภาพไมโครกราฟอิเล็กตรอนของส่วนของเอ็มบริโอพันธุ์ป่าที่มองเกินขอบเขตของเซลล์ปลายยอด-ฐาน แสดงบริเวณที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่นชัดเจนซึ่งบ่งชี้ถึงรอยต่อกาว (AA, ลูกศร)ในทางตรงกันข้ามในส่วนของตัวอ่อนกลายพันธุ์ Specc11 (BB, ลูกศร) ทางแยก apicobasal ทั้งหมดนั้นมีอิเล็กตรอนหนาแน่น ซึ่งบ่งบอกถึงความหนาแน่นที่เพิ่มขึ้นและการกระจายตัวของทางแยกกาว
เพื่อทดสอบสมมติฐานของเราว่าการลดชั้นเกิดขึ้นเนื่องจาก AJ ที่เปลี่ยนแปลง เราได้ตรวจสอบการติดฉลาก AJ ในรอยพับของระบบประสาทที่เปิดเผยของตัวอ่อนกลายพันธุ์ Specc1l (รูปที่ 5S-Z)เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นของเส้นใยความเครียดแอกติน (รูปที่ 5S, T) และการเพิ่มขึ้นของการย้อมสี myosin IIB บนเส้นใยแอกติน (รูปที่ 5U, V) ที่เพิ่มขึ้นร่วมกันที่สำคัญเราสังเกตเห็นการย้อมสีที่เพิ่มขึ้นของ β-catenin (รูปที่ 5W, X) และ E-cadherin (รูปที่ 5Y, Z) ที่ขอบเขตระหว่างเซลล์นอกจากนี้เรายังตรวจสอบการย้อมสี β-catenin ของ NCC ในรอยพับประสาทของตัวอ่อน E8.5 (รูปที่ 5K, L)การย้อมสี cat-catenin ดูเหมือนจะแข็งแกร่งขึ้นในรอยพับของระบบประสาทกลายพันธุ์ Specc1l (รูปที่ 5L และ K) ซึ่งบ่งชี้ว่าการเปลี่ยนแปลง AJ ได้เริ่มขึ้นแล้วในไมโครกราฟอิเล็กตรอนของส่วนกะโหลกศีรษะของตัวอ่อน E9.5 เราสังเกตเห็นการย้อมสีอิเล็กตรอนหนาแน่นเพิ่มขึ้นอีกครั้งในตัวอ่อนกลายพันธุ์ Specc1l เมื่อเปรียบเทียบกับ WT (รูปที่ 5AA, BB และ S1E-H)เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนผลลัพธ์ ในหลอดทดลอง ของเราในเซลล์ SPECC1L-kd U2OS และแนะนำว่าการย้อมสี AJ ที่ผิดปกตินำหน้าการแบ่งชั้น CNCC ในเอ็มบริโอกลายพันธุ์ของเรา
เมื่อพิจารณาถึงความสัมพันธ์ที่เป็นปฏิปักษ์ที่ทราบระหว่างกิจกรรม AKT และความเสถียรของ E-cadherin เราตั้งสมมติฐานการมีส่วนร่วมของการส่งสัญญาณ PI3K-AKTนอกจากนี้เรายังสังเกตเห็นพุพองใต้ผิวหนังในเอ็มบริโอกลายพันธุ์บางตัวของเราที่รอดพ้นจากความตาย (<5%) ที่ E9.5-10.5 และไปอยู่ที่ประมาณ E13.5 แทน (รูปที่ S3)ถุงใต้ผิวหนังเป็นจุดเด่นของการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ที่ลดลงซึ่งมีพื้นฐานบน PDGFRα12แฟนทอซโซ และคณะ(2014) รายงานว่าการหยุดชะงักของการกระตุ้น PI3K ที่ใช้ PDGFRα ในเอ็มบริโอกลายพันธุ์ PdgfraPI3K/PI3K ส่งผลให้เกิดถุงใต้ผิวหนัง ข้อบกพร่องของท่อประสาท และฟีโนไทป์ของเพดานโหว่แท้จริงแล้วระดับของ pan-AKT และ phosphorylated Ser473-AKT ที่ใช้งานอยู่ลดลง ในร่างกาย ในเนื้อเยื่อกลายพันธุ์ Specc1l ไปจนถึงการจับกุมตัวอ่อน E9.5 (รูปที่ 6A-D)การลดลงของระดับของฟอสโฟรีเลต Ser473-AKT อาจเกิดจากการลดลงในระดับของ pan-AKT ภายในร่างกาย (รูปที่ 6E) และภายนอกร่างกาย (รูปที่ 6F)การลดลง ในหลอดทดลอง สังเกตได้ก็ต่อเมื่อเซลล์ U2OS มาบรรจบกันอย่างมากกับการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์และความหนาแน่นของ AJ (รูปที่ 6D)ดังนั้นข้อมูลของเราแนะนำว่า SPECC1L เป็นตัวควบคุมเชิงบวกแบบใหม่ของการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ใน morphogenesis ของ craniofacial
( A – E ) E8.5 ( A, B ) และ E9.5 ( C, D ) ส่วนกะโหลกศีรษะหรือ E9.5 lysates จากตัวอ่อนกลายพันธุ์ Specc1l ( E ) แสดงระดับของ phosphorylated ที่ใช้งานอยู่ S473-AKT และ pan-AKT การลดโปรตีน เปรียบเทียบกับการควบคุม WTทำการซับแบบตะวันตกกับไลซีนชนิดไวด์และไลซีนกลายพันธุ์ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันรูปภาพที่แสดงสำหรับ SPECC1L ถูกนำมาจากหนึ่งหยดรอยเปื้อนเดียวกันถูกลบออกและตรวจสอบอีกครั้งด้วยแอนติบอดีต่อต้าน pan-ACT และ β-actinระดับ Pan-AKT ใน E8.5 neural fold (A, B) และระดับของ phosphorylated S473-AKT ในส่วนของกะโหลกศีรษะ E9.5 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ( F ) ระดับ Pan-AKT ลดลงในทำนองเดียวกันใน lysates ของเซลล์ SPECC1L-kd U2OS ที่เก็บเกี่ยวที่จุดบรรจบกันสูงแถบข้อผิดพลาดแสดงถึง SEM จากการวัดปริมาณ Western blot ที่เป็นอิสระสามรายการ(GJ) ส่วนของเอ็มบริโอ WT ที่ E9.5 ย้อมด้วย KI67 และ caspase 3 ที่แยกออก ตามลำดับ แสดงการเพิ่มจำนวนเซลล์ (G, G ') และกิจกรรมการตายของเซลล์เล็กน้อย (H, H ')เอ็มบริโอกลายพันธุ์ Specc11 แสดงการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่เทียบเคียงได้ (I) แต่จำนวนเซลล์ที่เกิดการตายของเซลล์จะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (J)
จากนั้นเราตรวจสอบเครื่องหมายของการแพร่กระจายและการตายของเซลล์เราไม่ได้สังเกตความแตกต่างใด ๆ ในการแพร่กระจายของตัวอ่อน E9.5 (รูปที่ 6E, G เทียบกับ I) โดยมีดัชนีการแพร่กระจาย 82.5% สำหรับการกลายพันธุ์ WT และ 86.5% สำหรับการกลายพันธุ์ Specc1l ที่วัดโดยการย้อม KI67 (p <0.56, Fisher's การทดสอบที่แน่นอน)ในทำนองเดียวกัน เราไม่ได้สังเกตเห็นความแตกต่างในการตายของเซลล์ที่วัดโดยการย้อมสีสำหรับ caspase 3 ที่แยกออกในรอยพับของประสาทที่ E8.5 จนกระทั่งตัวอ่อนหยุดนิ่ง (ไม่แสดง) (ไม่แสดง)ในทางตรงกันข้าม การตายของเซลล์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเอ็มบริโอกลายพันธุ์ E9.5 ทั้งหมด (รูปที่ 6F, H และ J)การตายของเซลล์โดยรวมที่เพิ่มขึ้นนี้สอดคล้องกับการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ที่ลดลงและการตายของตัวอ่อนในระยะเริ่มแรก
ต่อไป เพื่อยืนยันบทบาทเชิงสาเหตุสำหรับการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ในการเปลี่ยนแปลง AJ ในเซลล์ kd ของเรา เราได้เปลี่ยนวิถีทางเคมีในเซลล์ควบคุมและเซลล์ kd (รูปที่ 7A-F)เราใช้เป็นเครื่องหมายของฟีโนไทป์การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ที่สังเกตได้ในเซลล์ SPECC1L-kd ที่ไหลมารวมกัน ซึ่งเราหาปริมาณโดยใช้อัตราส่วนของมิติที่ยาวที่สุด (ความยาว) ต่อมิติแนวตั้งที่สอดคล้องกัน (ความกว้าง)คาดว่าอัตราส่วน 1 สำหรับเซลล์ที่ค่อนข้างกลมหรือทรงลูกบาศก์ (รูปที่ 7G)นอกจากรูปร่างของเซลล์แล้ว เรายังยืนยันผลของ AJ โดยการย้อมสี β-catenin (รูปที่ 7A'-F ')การยับยั้งวิถีทาง PI3K-AKT โดยใช้เวิร์ทแมนนินนั้นเพียงพอที่จะเปลี่ยนรูปร่างของเซลล์ในเซลล์ควบคุม (รูปที่ 7A, C) และ AJ (รูปที่ 7A ')แอคติเวเตอร์ PI3K-AKT SC-79 ไม่ส่งผลต่อรูปร่างของเซลล์ (รูปที่ 7A, E) หรือการขยายตัวของ AJ (รูปที่ 7A') ในเซลล์ควบคุมในเซลล์ SPECC1L-kd การปราบปรามเส้นทาง PI3K-AKT เพิ่มเติมส่งผลให้เกิดการตายของเซลล์เพิ่มขึ้น (รูปที่ 7B, D) และการเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในการย้อมสี β-catenin (รูปที่ 7B ') ซึ่งสอดคล้องกับการกลายพันธุ์หนัก ในร่างกาย ของเราที่สำคัญการเปิดใช้งานเส้นทาง PI3K-AKT ช่วยปรับปรุงรูปร่างของเซลล์ (รูปที่ 7B, F) และฟีโนไทป์ AJ (รูปที่ 7B) อย่างมีนัยสำคัญการเปลี่ยนแปลงในรูปร่างของเซลล์ถูกหาปริมาณเป็นอัตราส่วนความกลมของเซลล์ (CCR) และถูกเปรียบเทียบสำหรับนัยสำคัญตามที่บรรยายไว้ข้างต้น (รูปที่ 7G)แท้จริงแล้วในเซลล์ควบคุม (รูปที่ 7G, CCR = 1.56) การบำบัดด้วยเวิร์ทแมนนินก็เพียงพอที่จะเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) ในขอบเขตที่คล้ายคลึงกับที่สังเกต ใน SPECC1L-kd เซลล์ (รูปที่ 7G, CCR = 3.46)การรักษา Wortmannin ของเซลล์ SPECC1L-kd (รูปที่ 7G, CCR = 3.60, เล็กน้อย) ไม่มีนัยสำคัญมากกว่าเซลล์ kd ที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 7G, CCR = 3.46, เล็กน้อย) หรือเซลล์ควบคุมที่ได้รับการรักษาด้วย wortmannin (รูปที่ 7G), CCR = 3.46, เล็กน้อย) ส่งผลต่อการยืดตัวของเซลล์เพิ่มเติม (7G, CCR = 3.61, เล็กน้อย)สิ่งสำคัญที่สุดคือ SC-79 AKT activator คืนฟีโนไทป์ที่ยาวขึ้นของเซลล์ SPECC1L-kd (รูปที่ 7G, CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12)ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันว่า SPECC1L ควบคุมการส่งสัญญาณ PI3K-AKT และแนะนำว่าการลดลงปานกลางใน SPECC1L ส่งผลต่อการยึดเกาะของเซลล์ ในขณะที่การลดลงอย่างมากทำให้เกิดการตายของเซลล์ (รูปที่ 8)
(A – F ') การควบคุม (A, C, E) และเซลล์ SPECC1L-kd (B, D, F) ที่ได้รับการรักษาด้วย PI3K-AKT ทางเดินยับยั้ง wortmannin (C, D) หรือ SC-79 activator (E, F) เซลล์ควบคุมที่ไม่ได้รับการบำบัดจะเป็นทรงลูกบาศก์ (A) โดยมีการย้อมสีเซลล์ β-cat ปกติ (A') ในขณะที่เซลล์ kd จะถูกยืดออก (B) โดยมีการย้อมสี β-cat เพิ่มขึ้น (B')หลังจากการปราบปรามทางเดิน PI3K-AKT เซลล์ควบคุมจะยืดออก (C) ด้วยการขยายตัว cat-cat (C ') ในขณะที่เซลล์ kd เริ่มเกิดการตายของเซลล์ (D) คล้ายกับตัวอ่อนที่กลายพันธุ์สูงของเราและแสดง cat-cat ที่ได้รับการปรับปรุงอย่างมากการย้อมสี (D')หลังจากเปิดใช้งานทางเดิน PI3K-AKT เซลล์ควบคุมยังคงเป็นทรงลูกบาศก์ (E) และมีการย้อมสี β-cat (E ') ปกติ ในขณะที่เซลล์ kd แสดงรูปร่างของเซลล์ที่ดีขึ้น (F ) และการย้อมสี β-cat (F ') อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่า (G) ระดับของการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ใน (AF) ถูกหาปริมาณโดยใช้อัตราส่วนความกลมของเซลล์ (CCR) ของมิติที่ยาวที่สุด (ความยาว) และมิติแนวตั้งที่สอดคล้องกัน (ความกว้าง) โดยใช้ซอฟต์แวร์ MetaMorphเซลล์ SPECC1L-kd ที่ไม่ได้รับการรักษา (NT) (CCR = 3.46) มีความยาวมากกว่าเซลล์ควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13)การยับยั้งทางเดิน PI3K-AKT ของ Wort ในเซลล์ควบคุมนั้นเพียงพอที่จะทำให้เกิดการยืดตัวในรูปร่างของเซลล์ที่คล้ายกัน (CCR=3.61, p<2.4×10-9)ในทำนองเดียวกันการเปิดใช้งาน AKT โดย SC-79 ในเซลล์ SPECC1L-kd คืนค่าการยืดตัวของเซลล์เพื่อควบคุมระดับ (CCR = 1.74, p < 6.2 × 10–12)การบำบัดด้วยวอร์ทแมนนินของเซลล์ SPECC1L-kd ส่งผลให้เกิดการตายของเซลล์เพิ่มขึ้น แต่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์เพิ่มขึ้นอีก (CCR=3.60) เมื่อเปรียบเทียบกับ kd ที่ไม่ได้รับการรักษา (CCR=3.46, ns) หรือเซลล์ควบคุมที่ได้รับการบำบัดด้วยเวิร์ทแมนนิน (3.61) ที่สังเกตพบในns = ไม่สำคัญ+/- การวัด SEM สำหรับ 50 เซลล์จะแสดงขึ้นความแตกต่างทางสถิติคำนวณโดยใช้การทดสอบของนักเรียน
( A ) การแสดงแผนผังของการยับยั้งและการเปิดใช้งานเส้นทาง PI3K-AKT ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงและช่วยเหลือ AJ ตามลำดับ( B ) แบบจำลองที่เสนอสำหรับการรักษาเสถียรภาพโปรตีน AKT โดย SPECC1L
CNCCs ก่อนย้ายถิ่นต้องการ AJ lysis เพื่อแยกออกจากเซลล์ neuroepithelial พับของเส้นประสาทส่วนหน้าเพิ่มการย้อมสีของส่วนประกอบ AJ และการสูญเสียการกระจายแบบไม่สมมาตรของ apical-basal AJ ในเซลล์ที่ขาด SPECC1L ทั้ง ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย รวมกับความใกล้ชิดทางกายภาพของ SPECC1L ถึง β-catenin แนะนำว่าฟังก์ชัน SPECC1L เพื่อรักษาเสถียรภาพ AJ ในท้องถิ่นอย่างเหมาะสมสำหรับ กล้ามเนื้อขององค์กรแอกตินโครงร่างโครงร่างการเชื่อมโยงของ SPECC1L กับโครงร่างโครงร่างของเซลล์แอกตินและ cat-catenin และการเพิ่มขึ้นของจำนวนเส้นใยแอกตินแบบควบแน่นในกรณีที่ไม่มี SPECC1L นั้นสอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของความหนาแน่น AJ ที่สังเกตได้ความเป็นไปได้อีกอย่างหนึ่งก็คือการเพิ่มจำนวนเส้นใยแอคตินในเซลล์ที่ขาด SPECC1L ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของความตึงเครียดระหว่างเซลล์เนื่องจากความเครียดของเซลล์ส่งผลต่อไดนามิกของ AJ 33 การเปลี่ยนแปลงแรงดันไฟฟ้าอาจส่งผลให้ AJ 34 กระจายมากขึ้นดังนั้นการเปลี่ยนแปลงใดๆ จะส่งผลต่อเลเยอร์ CNCC
Wnt1 แสดงออกในรอยพับของระบบประสาทช่วงต้นที่ก่อให้เกิดเซลล์ยอดประสาทดังนั้นการติดตามเชื้อสาย Wnt1-cre จึงทำเครื่องหมายทั้งก่อนและการย้าย NCC35อย่างไรก็ตาม Wnt1 ยังทำเครื่องหมายโคลนเนื้อเยื่อสมองด้านหลังซึ่งได้มาจากรอยพับของระบบประสาทตอนต้น 35,36 ทำให้มีแนวโน้มว่าการย้อมสีการกลายพันธุ์ E9.5 ของเราสำหรับเครื่องหมาย Wnt1 ในรอยพับของประสาทแบบเปิดไม่ใช่ CNCCการย้อมสีเชิงบวกของเราสำหรับเครื่องหมาย NCC AP2A และ SOX10 ยืนยันว่ารอยพับของระบบประสาทที่ถูกเปิดเผยของตัวอ่อนกลายพันธุ์ Specc11 นั้นมี CNCC อยู่จริงนอกจากนี้ เนื่องจาก AP2A และ SOX10 เป็นเครื่องหมายของการย้าย NCC ในระยะแรก การย้อมสีเชิงบวกบ่งชี้ว่าเซลล์เหล่านี้เป็น CNCC หลังการย้ายถิ่นซึ่งไม่สามารถแบ่งชั้นด้วย E9.5
ข้อมูลของเราแนะนำว่าการควบคุมระดับโมเลกุลของ AJ โดย SPECC1L นั้นถูกสื่อกลางโดยการส่งสัญญาณ PI3K-AKTการส่งสัญญาณ AKT จะลดลงในเซลล์และเนื้อเยื่อที่ขาด SPECC1Lผลการวิจัยโดย Fantauzzo และคณะสนับสนุนบทบาทโดยตรงสำหรับการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ใน morphogenesis ของ craniofacial(2014) แสดงให้เห็นว่าการขาดการกระตุ้นการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ที่มีพื้นฐานจาก PDGFRα นำไปสู่ฟีโนไทป์ของเพดานโหว่นอกจากนี้เรายังแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งเส้นทาง PI3K-AKT นั้นเพียงพอที่จะเปลี่ยน AJ และรูปร่างของเซลล์ในเซลล์ U2OSสอดคล้องกับการค้นพบของเรา Cain และคณะ37 แสดงให้เห็นว่าการลดลงของหน่วยย่อย PI3K α110 ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดส่งผลให้เกิดการเพิ่มขึ้นที่คล้ายกันในการย้อมสี β-catenin ในเซลล์ ซึ่งเรียกว่าการเพิ่มขึ้นของ "ดัชนีการเชื่อมต่อ"อย่างไรก็ตาม ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดซึ่งมีเส้นใยแอกตินมีการจัดระเบียบสูงอยู่แล้ว การปราบปรามวิถีทาง PI3K-AKT ส่งผลให้เซลล์มีรูปร่างหลวมในทางตรงกันข้าม เซลล์ SPECC1L-kd U2OS แสดงรูปร่างของเซลล์ที่ยาวขึ้นความแตกต่างนี้อาจเฉพาะเจาะจงกับประเภทเซลล์ในขณะที่การปราบปรามการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ส่งผลกระทบอย่างถาวรต่อโครงร่างโครงร่างเซลล์ของแอกติน ผลกระทบต่อรูปร่างของเซลล์จะถูกกำหนดโดยการเปลี่ยนแปลงของความตึงเครียดที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงในความหนาแน่นและการจัดระเบียบของเส้นใยแอกตินส่วนกลางในเซลล์ U2OS เราใช้เฉพาะการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์เป็นเครื่องหมายของการเปลี่ยนแปลงและการกู้คืน AJ ที่ขาด SPECC1Lโดยสรุป เราตั้งสมมติฐานว่าการยับยั้งเส้นทาง AKT ในการขาด SPECC1L เพิ่มความเสถียรของ AJ และลดการหลุดลอกใน CNCC
สิ่งที่น่าสนใจคือระดับ pan-AKT ลดลง ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย นอกเหนือจากระดับ phosphorylated 473-AKT ในกรณีที่ไม่มี SPECC1L ซึ่งแนะนำการควบคุมการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ที่ระดับความเสถียรของโปรตีน AKT หรือการหมุนเวียนยีน SPECC1L และ MID1 ซึ่งทั้งสองเกี่ยวข้องกับกลุ่มอาการ Opitz/GBBB เข้ารหัสโปรตีนที่ทำให้ไมโครทูบูลเสถียร 18,22กลไกที่ SPECC1L และ MID1 เป็นสื่อกลางในการรักษาเสถียรภาพของไมโครทูบูลนั้นยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ในกรณีของ SPECC1L การรักษาเสถียรภาพนี้รวมถึงอะซิติเลชั่นที่ได้รับการปรับปรุงของชุดย่อยของไมโครทูบูล 18เป็นไปได้ที่ SPECC1L จะใช้กลไกที่คล้ายกันเพื่อรักษาเสถียรภาพของโปรตีนอื่น ๆ เช่น AKTแสดงให้เห็นว่าอะซิติเลชั่นของไลซีนที่ตกค้างในโปรตีน AKT ส่งผลให้การแปลเมมเบรนและฟอสโฟรีเลชั่นลดลงนอกจากนี้จำเป็นต้องมีการแพร่หลายของโซ่ K63 ที่ไลซีนตกค้างบน AKT สำหรับการแปลเมมเบรนและการเปิดใช้งานในบรรดาปัจจัยหลายประการที่มีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีน SPECC1L ที่ระบุในหน้าจอสองไฮบริดของยีสต์ที่มีปริมาณงานสูงต่างๆ สี่ตัว - CCDC841, ECM2942, APC และ UBE2I43 - มีส่วนเกี่ยวข้องกับการหมุนเวียนของโปรตีนหรือความเสถียรผ่านการแพร่หลายหรือซูโมเลชั่นSPECC1L อาจเกี่ยวข้องกับการดัดแปลงหลังการแปลของ AKT ไลซีนที่ตกค้าง ซึ่งส่งผลต่อความเสถียรของ AKTอย่างไรก็ตามบทบาทที่สำคัญของ SPECC1L ในการแปลและความเสถียรของโปรตีน AKT ยังคงต้องมีการอธิบายอย่างชัดเจน
ข้อบกพร่องที่รุนแรงในการแสดงออก SPECC1L ในวิฟ ส่งผลให้การย้อมสีเครื่องหมาย AJ เพิ่มขึ้นและการซ้อนทับ CNCC ที่มีข้อบกพร่อง เช่นเดียวกับการตายของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นและการตายของตัวอ่อนในระยะแรกรายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ของเมาส์ที่มีระดับการตายของเซลล์เพิ่มขึ้นสัมพันธ์กับข้อบกพร่องของท่อประสาท 44, 45, 46, 47 และข้อบกพร่องของกะโหลกศีรษะและใบหน้ามีการเสนอแนะว่าการตายของเซลล์มากเกินไปในรอยพับของเส้นประสาทหรือส่วนโค้งของคอหอยอาจส่งผลให้จำนวนเซลล์ไม่เพียงพอที่จำเป็นสำหรับการเคลื่อนไหวทางสัณฐานวิทยาที่เหมาะสม 48,49,50ในทางตรงกันข้าม เส้นเซลล์ที่ขาด SPECC1L ของเราซึ่งมีการแสดงออก SPECC1L ที่ลดลงปานกลางแสดงให้เห็นเฉพาะการเปลี่ยนแปลง AJ โดยไม่มีหลักฐานการตายของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นอย่างไรก็ตาม การยับยั้งทางเคมีของวิถีทาง PI3K-AKT ในเซลล์ Kd เหล่านี้ส่งผลให้เกิดการตายของเซลล์เพิ่มขึ้นดังนั้นการแสดงออกหรือฟังก์ชัน SPECC1L ที่ลดลงปานกลางทำให้มั่นใจได้ถึงความอยู่รอดของเซลล์ซึ่งสอดคล้องกับการสังเกตว่าเอ็มบริโอกลายพันธุ์ Specc11 ที่หายากซึ่งรอดพ้นจากการจับกุมที่เซนต์ปีเตอร์สเบิร์กE9.5 อาจเนื่องมาจากประสิทธิภาพในการจับยีนที่ลดลง สามารถปิดท่อประสาทและหยุดการพัฒนาในภายหลังได้ โดยมักมีข้อบกพร่องของกะโหลกศีรษะ (รูปที่ S3)สิ่งที่สอดคล้องกับสิ่งนี้คือการเกิดที่หายากของตัวอ่อน Specc1l แบบเฮเทอโรไซกัสที่มีความผิดปกติของกะโหลกศีรษะ - อาจเนื่องมาจากประสิทธิภาพการจับยีนที่เพิ่มขึ้น - เช่นเดียวกับการค้นพบในเซบีริชซึ่งหนึ่งในสอง SPECC1L orthologues (specc1lb) ทำให้เกิดฟีโนไทป์ของตัวอ่อนตอนปลาย รวมถึงการสูญเสีย ขากรรไกรล่างและแหว่งทวิภาคี51ดังนั้นการกลายพันธุ์ที่สูญเสียการทำงานของ SPECC1L แบบเฮเทอโรไซกัสที่ระบุในผู้ป่วยมนุษย์อาจทำให้เกิดความบกพร่องเล็กน้อยในการทำงานของ SPECC1L ในระหว่างการสร้างสัณฐานวิทยาของใบหน้าของกะโหลกศีรษะ ซึ่งเพียงพอที่จะอธิบายรอยแหว่งของช่องปากได้การควบคุมการติดต่อระหว่างเซลล์ตาม SPECC1L อาจมีบทบาทในการสร้างเพดานปากและการหลอมรวมของส่วนโค้งของคอหอยการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับฟังก์ชั่น SPECC1L จะช่วยอธิบายบทบาทของการสัมผัสระหว่างเซลล์ชั่วคราวใน CNCC ในระหว่างการปิดท่อประสาทในการเคลื่อนที่ของเซลล์ประสาทและการสร้างรูปร่างของกะโหลกศีรษะและใบหน้า
การควบคุมโรคกระดูกพรุน U2OS และเซลล์ SPECC1L-kd ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Saadi et al., 2011)แอนติบอดีต่อ SPECC1L นั้นมีลักษณะเฉพาะก่อนหน้านี้ (Saadi et al., 2011)แอนติบอดีต่อต้าน β-catenin (กระต่าย; 1:1000; ซานตาครูซ, ดัลลัส, เท็กซัส) (เมาส์; 1:1000; เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์, Danvers, MA), ไมโอซิน IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, เซนต์หลุยส์ ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , แคลิฟอร์เนีย), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ) , KI67 (1:1000; เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์, Danvers, MA), แคสเพสแบบแยกส่วน 3 (1:1000; เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์, Danvers, MA) และ β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) ถูกใช้ตามที่อธิบายไว้.เส้นใยแอคตินถูกย้อมด้วย Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado)
เซลล์ควบคุม U2OS และเซลล์ SPECC1L-kd ได้รับการเพาะเลี้ยงใน DMEM กลูโคสสูงมาตรฐานเสริมด้วยซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA)สำหรับการเปลี่ยนแปลง AJ เซลล์ 2 x 105 ถูกเพาะบนแก้วที่บำบัดด้วยเจลาตินสุกร 0.1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) และสังเกตการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์เซลล์ถูกรวบรวม ณ จุดเวลาที่ระบุต่างกัน: 4 ชั่วโมงหลังจากการเพาะ (t = 1), 24 ชั่วโมงหลังจากการเพาะ (t = 2), การบรรจบกันโดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ (t = 3), การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ (t = 4) , 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ (t = 5) และ 48 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ (t = 6) (รูปที่ 1, 2, 3)เพื่อปรับวิถีวิถีทาง PI3K-AKT เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงที่ความเข้มข้นที่ระบุด้วยวอร์ตแมนนินที่เป็นสารยับยั้ง PI3K-AKT (TOCRIS Biosciences, มินนีแอโพลิส, มินนิโซตา) หรือตัวกระตุ้น SC-79 (TOCRIS Biosciences, มินนีแอโพลิส อดัมส์, มินนิโซตา)มีการเปลี่ยนสื่อที่มีสารเคมีทุกวัน
การบันทึกแบบเฟรมต่อเฟรมถูกสร้างขึ้นบนไลฟ์คอนโทรลและเซลล์ KD ภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงปกติ และภาพคอนทราสต์เฟสถูกรวบรวมทุกๆ 10 นาทีเป็นเวลา 7 วันภาพได้มาจากกล้องจุลทรรศน์กลับหัว Leica DM IRB ที่ควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์ซึ่งมีเวทีเชิงกลและวัตถุประสงค์ 10 × N-PLAN ที่เชื่อมต่อกับกล้อง QImaging Retiga-SRVในระหว่างการถ่ายภาพ การเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกคงไว้ที่ 37°C ในบรรยากาศชื้นที่มี CO2 5%
เซลล์ดักจับยีน ES สองสาย DTM096 และ RRH048 จากศูนย์ทรัพยากรเมาส์กลายพันธุ์ระดับภูมิภาค (UC Davis, CA) ถูกนำมาใช้เพื่อสร้างเส้นเมาส์ที่บกพร่อง Specc11 ซึ่งกำหนด Specc1lgtDTM096 และ Specc1lgtRRH046โดยสรุป เซลล์ 129/REJ ES ถูกฉีดเข้าไปในบลาสโตซิสต์ C57BL6หนูตัวผู้ที่เป็นไคเมอริกถูกผสมพันธุ์กับหนู C57BL6 ตัวเมียเพื่อระบุลูกหลานที่มีสีเคลือบอะกูติการมีอยู่ของส่วนแทรกเวกเตอร์กับดักยีนถูกนำมาใช้เพื่อระบุเฮเทอโรไซโกตหนูเมาส์ถูกเก็บไว้บนพื้นหลังผสมของ 129/REJ;C57BL6ตำแหน่งของตำแหน่งแทรกของเวกเตอร์กับดักทางพันธุกรรมได้รับการยืนยันโดย RT-PCR การจัดลำดับจีโนม และการเสริมทางพันธุกรรม (รูปที่ 1 เพิ่มเติม)เพื่อติดตามเชื้อสาย CNCC ของหนู Specc1lGT แบบเฮเทอโรไซกัสคู่ ROSAmTmG (#007576) และ Wnt1-Cre (#003829) หนู (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ถูกข้ามเพื่อผลิต ROSAmTmG และ Wnt1-Cre อัลลีลในตัวอ่อนกลายพันธุ์ Specc1lการทดลองทั้งหมดในหนูดำเนินการตามระเบียบการที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยแคนซัส
ตัวอ่อนได้รับการแก้ไขใน (ฟอร์มาลดีไฮด์ 1%, กลูตาราลดีไฮด์ 0.2%, MgCl2 2 มิลลิโมลาร์, 0.02% NP-40, EGTA 5 มิลลิโมลาร์) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องหลังจากการตรึงในสารละลายการย้อมสี X-gal (โพแทสเซียม เฟอร์ริไซยาไนด์ 5 มิลลิโมลาร์, โพแทสเซียม เฟอร์โรไซยาไนด์ 5 มิลลิโมลาร์, 2 มิลลิโมลาร์ MgCl2, โซเดียมดีออกซีโคเลต 0.01%, 0.02% NP-40, 1 มก./มล. X-แกลลอน) การพัฒนาของคราบถูกดำเนินการที่ 37°C .°C ภายใน 1-6 ชั่วโมงเอ็มบริโอถูกตรึงภายหลังใน 4% PFA และมองเห็นได้
สำหรับการซับแบบตะวันตก เซลล์จะถูก lysed ในบัฟเฟอร์ lysis แบบพาสซีฟ (Promega, Fitchburg, WI) เสริมด้วยส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอส HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)ไลซีนถูกประมวลผลบนเจลสำเร็จรูปโพลีอะคริลาไมด์ Mini-PROTEAN TGX 12% (Bio-Rad, Hercules, CA) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA)เยื่อถูกปิดกั้นในนม 5% ใน PBS ที่มีทวีน 0.1%แอนติบอดีถูกบ่มข้ามคืนที่ 4°ซ หรือเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องรีเอเจนต์ Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) ใช้สำหรับการสร้างสัญญาณสำหรับการสร้างภูมิคุ้มกัน เอ็มบริโอได้รับการแก้ไขข้ามคืนใน 4% PFA/PBS และเก็บรักษาด้วยการแช่แข็งการแช่แข็งเนื้อเยื่อถูกบล็อกใน PBS ที่มีซีรั่มแพะปกติ 1% (Thermo Scientific, Waltham, MA) และ 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) จากนั้นบ่มที่ 4 ° C ในตู้ฟักในระหว่าง กลางคืน.ด้วยแอนติบอดีและแอนติบอดีทุติยภูมิเรืองแสง (1:1000) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4°Cส่วนที่เปื้อนถูกวางไว้ในตัวกลางทองคำ ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) และรับภาพแบนโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล Leica TCS SPEการสร้างภูมิคุ้มกันแต่ละครั้งดำเนินการเป็นการทดลองอิสระสามครั้งในการตัดไซโรสของตัวอ่อนกลายพันธุ์อย่างน้อยสองตัวมีการแสดงการทดลองตัวแทน
เซลล์ถูกบ่มในบัฟเฟอร์ RIPA ดัดแปลง (20 มิลลิโมลาร์ Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 มิลลิโมลาร์ NaCl, 10% กลีเซอรอล, 2 มิลลิโมลาร์ EDTA และสารยับยั้งโปรตีเอส HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) โดยสังเขป ไลซีนถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยเม็ดแม่เหล็กโปรตีน G (Life Technologies, Carlsbad, CA) จากนั้นบ่มในชั่วข้ามคืนที่ 4 ° C โดยใช้เม็ดโปรตีน G ของ anti-SPECC1L หรือ IgG โปรตีนเพื่อแยก SPECC1L และ Western blotting ดำเนินการโดยใช้สารต่อต้าน แอนติบอดี -β-catenin ที่อธิบายไว้ข้างต้น การทดลอง co-IP ที่แสดงเป็นตัวแทนของการทดลองอิสระสี่รายการ
เซลล์เพาะเลี้ยงคงที่หรือเนื้อเยื่อตัวอ่อนของหนูถูกจัดเตรียมให้กับศูนย์กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนที่ศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยแคนซัสโดยสรุป ตัวอย่างถูกฝังในเรซิน EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) ทำให้เกิดปฏิกิริยาโพลีเมอร์ข้ามคืนที่ 60°C และแบ่งส่วนที่ 80 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอัลตราไมโครโตม Leica UC7 ที่ติดตั้งใบมีดเพชรส่วนต่างๆ ถูกมองเห็นโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน JEOL JEM-1400 ที่ติดตั้งปืน 100 kV Lab6
วิธีอ้างอิงบทความนี้ : Wilson, NR และคณะการขาด SPECC1L นำไปสู่ความเสถียรที่เพิ่มขึ้นของข้อต่อที่ประกบกันและลดการหลุดของเซลล์ประสาทในกะโหลกศีรษะวิทยาศาสตร์.6, 17735;ดอย:10.1038/srep17735 (2016)
แซงต์-จีนน์ เจ.-พี.การเหนี่ยวนำและการแยกความแตกต่างของยอดประสาท(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006)
คอร์เดโร DR และคณะเซลล์ประสาทสมองที่กำลังเคลื่อนไหว: บทบาทในการพัฒนากะโหลกศีรษะและใบหน้าวารสารพันธุศาสตร์การแพทย์อเมริกัน.ส่วน A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011)
Boland, RP Neurocristopathia: การเติบโตและการพัฒนาตลอด 20 ปีกุมารแพทย์.พยาธิวิทยาห้องปฏิบัติการ.ยา.17, 1–25 (1997)
Mangold E. , Ludwig KU และ Noten MM ความก้าวหน้าทางพันธุศาสตร์ของรอยแยกของช่องปากแนวโน้มการแพทย์ระดับโมเลกุล 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011)
Minu, M. และ Riley, FM กลไกระดับโมเลกุลของการย้ายถิ่นและการสร้างรูปแบบของเซลล์ประสาทในกะโหลกศีรษะในระหว่างการพัฒนาของกะโหลกศีรษะการพัฒนา 137, 2605–2621, ดอย: 10.1242/dev.040048 (2010)
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH และ Murray, JK ปากแหว่งและเพดานปาก: ทำความเข้าใจอิทธิพลทางพันธุกรรมและสิ่งแวดล้อมความคิดเห็นที่เป็นธรรมชาติพันธุศาสตร์ 12, 167–178, ดอย: 10.1038/nrg2933 (2011)
อินแกรม, CR และคณะmorphogenesis ที่ผิดปกติของผิวหนัง แขนขา และบริเวณกะโหลกศีรษะและใบหน้าในหนูที่ขาด interferon-regulating factor-6 (Irf6)เจเน็ตแห่งชาติ.38, 1335–1340, ดอย: 10.1038/ng1903 (2006)
Peyrard-Janvid, M. และคณะการกลายพันธุ์ที่โดดเด่นใน GRHL3 ทำให้เกิดอาการ van der Waord และทำให้การพัฒนาของเยื่อบุช่องปากลดลงAm J Hum Genet 94, 23–32, ดอย: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014)
Harris, MJ และ Juriloff, DM อัปเดตรายชื่อหนูกลายพันธุ์ที่มีข้อบกพร่องในการปิดท่อประสาทและความคืบหน้าไปสู่ความเข้าใจทางพันธุกรรมที่สมบูรณ์ของการปิดท่อประสาทการสอบสวนความพิการแต่กำเนิดส่วน A วิทยาคลินิกและโมเลกุล 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010)
Fantauzzo, KA & Soriano, การส่งสัญญาณ PDGFRalpha ที่เป็นสื่อกลางของ P. PI3K ควบคุมการอยู่รอดและการแพร่กระจายในการพัฒนาโครงกระดูกผ่านทางเดินภายในเซลล์ที่ขึ้นกับ p53การพัฒนายีน 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014)
Kopp, AJ, Green, ND และ Murdoch, JN Disheveled: ความสัมพันธ์ของการขยายตัวแบบลู่เข้าหากันกับการปิดท่อประสาทแนวโน้มทางประสาทวิทยา26, 453–455, ดอย: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003)