ส่วนประกอบทางเคมีของท่อขดสแตนเลส 347 การจำแนกโปรตีนพี่เลี้ยงของเม็ดเลือดขาวแอนติเจนเอ (HLA-A) ที่ตอบสนองต่ออินเตอร์เฟอรอนแบบใหม่โดยใช้แมสสเปกโตรมิเตอร์แบบเชื่อมโยงข้าม (CLMS)

ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comคุณกำลังใช้เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่มีการรองรับ CSS แบบจำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
แถบเลื่อนแสดงสามบทความต่อสไลด์ใช้ปุ่มย้อนกลับและปุ่มถัดไปเพื่อเลื่อนไปตามสไลด์ หรือใช้ปุ่มตัวควบคุมสไลด์ที่ส่วนท้ายเพื่อเลื่อนไปตามแต่ละสไลด์

รายละเอียดสินค้า

ท่อคอยล์สแตนเลส 347L เกรดเหล็ก: SS347L

ระบบการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอนกระตุ้นการตอบสนองของไซโตไคน์ที่แข็งแกร่งต่อสัญญาณทางพยาธิวิทยาที่ทำให้เกิดโรคและจากภายในที่หลากหลายจากสิ่งแวดล้อม ส่งผลให้เกิดการเหนี่ยวนำชุดย่อยของโปรตีนที่เหนี่ยวนำด้วยอินเตอร์เฟอรอนเราใช้แมสสเปกโตรมิเตอร์แบบ cross-link cross-link (CLMS) ที่ใช้สื่อกลาง DSS เพื่อตรวจจับปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีนใหม่ในโดเมนของโปรตีนที่เกิดจากอินเตอร์เฟอรอนนอกเหนือจากโปรตีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดอินเตอร์เฟอรอนที่คาดหวังแล้ว เรายังระบุ adducts ที่เชื่อมโยงระหว่างโมเลกุลและภายในโมเลกุลแบบใหม่ของโปรตีนที่เหนี่ยวนำด้วยอินเตอร์เฟอรอนที่เป็นที่ยอมรับเช่น MX1, USP18, OAS3 และ STAT1เรามุ่งเน้นไปที่การตรวจสอบมุมฉากของชุดใหม่ของเครือข่ายโปรตีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดอินเตอร์เฟอรอนที่เกิดจากโปรตีน HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) โดยใช้การตกตะกอนร่วมและการศึกษาเพิ่มเติมโดยใช้การสร้างแบบจำลองพลวัตของโมเลกุลการสร้างแบบจำลองพลวัตเชิงโครงสร้างของโปรตีนเชิงซ้อนเผยให้เห็นตำแหน่งอันตรกิริยาต่างๆ ที่สะท้อนถึงอันตรกิริยาที่ระบุไว้ในการค้นพบของ CLMSเรานำเสนอการศึกษานำร่องของ CLMS ร่วมกันเพื่อระบุคอมเพล็กซ์การส่งสัญญาณใหม่ที่เกิดจากอินเตอร์เฟอรอน และหวังว่าจะใช้ CLMS ในวงกว้างมากขึ้นเพื่อระบุพลวัตใหม่ของปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก
ก่อนที่การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวจะเริ่มต้นขึ้น ระบบการป้องกันโดยธรรมชาติของโฮสต์จะติดตั้งการตอบสนองของยาต้านจุลชีพที่อาศัยสื่อกลางโดยตระกูลของไซโตไคน์แบบอัลฟาเฮลิคัลที่ถูกหลั่งออกมาที่เรียกว่าอินเตอร์เฟอรอน (IFN)คลาส IFN ประเภท IFNα และ IFNβ กระตุ้นการตอบสนองของเซลล์ รวมถึงสภาวะต้านไวรัส ภาวะโพรอะพอพโทติค การอักเสบ และภาวะการเจริญของเซลล์ในมนุษย์ รู้จักชนิดย่อยของIFNα 13 ชนิด โดยทั้งหมดรวมอยู่ในโครโมโซม 91 น่าแปลกที่มีการศึกษาเฉพาะ IFNα2 เพื่อใช้ทางคลินิกเท่านั้นเมื่อเร็วๆ นี้ มีการให้ความสนใจเป็นพิเศษกับการวิจัยเกี่ยวกับชนิดย่อยอื่นๆ ของIFNαการศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่า IFNα14 เป็นหนึ่งในไอโซฟอร์มที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในการจำกัดการจำลองแบบ HBV2 และ HIV-13,4 เมื่อเปรียบเทียบกับชนิดย่อย IFNα2 ที่เป็นที่ยอมรับ
เป็นที่ยอมรับแล้วว่าคอมเพล็กซ์ตัวรับอินเตอร์เฟอรอนชนิดที่ 1 (IFNAR1 และ IFNAR2) กระตุ้นการถ่ายทอดสัญญาณที่สื่อกลางโดย Janus kinases TYK2 และ JAK15,6Janus kinase เหล่านี้แปลงสัญญาณฟอสโฟรีเลทและตัวกระตุ้นโปรตีนการถอดรหัส (STAT1 และ STAT2) บนไทโรซีนที่ตกค้างเพื่อเริ่มต้นเฮเทอโรไดเมอไรเซชันที่ใช้โดเมน SH2ต่อจากนั้น IRF9 ผูกเฮเทอโรไดเมอร์ของ STAT เพื่อสร้างคอมเพล็กซ์ไตรเมอริกของยีน IFN-stimulated factor 3 (ISGF3) ซึ่งจะย้ายไปยังนิวเคลียสและทำให้เกิดการถอดรหัสของยีนที่กระตุ้นอินเตอร์เฟอรอน (ISG) มากกว่า 2,000 ยีน (ISG)
ISG เป็นกระดูกสันหลังของระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการตอบสนองต่อการโจมตีของไวรัสเพื่อเป็นการป้องกันขั้นแรกต่อการติดเชื้อไวรัส เซลล์จะทำปฏิกิริยาอย่างรวดเร็วของโปรตีนในเซลล์พร้อมกับกิจกรรมทางชีวภาพที่หลากหลายโปรตีนเหล่านี้รวมถึงตัวรับการจดจำรูปแบบ โมเลกุลส่งสัญญาณ ปัจจัยการถอดรหัส และโปรตีนที่มีการทำหน้าที่ต้านไวรัสโดยตรง รวมถึงตัวควบคุมเชิงลบของการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันข้อมูลส่วนใหญ่เกี่ยวกับกิจกรรม ISG มาจากหน้าจอการทำงานที่ใช้หน้าจอการแสดงออกมากเกินไป หรือเทคนิคการปิดเสียงของยีน (siRNA, RNAi และ CRISPR) ซึ่ง ISG แต่ละรายการถูกแสดงหรือยับยั้ง และกิจกรรมของพวกเขาได้รับการทดสอบกับไวรัสต่างๆแม้ว่าการศึกษาเหล่านี้จะพิจารณาคุณสมบัติต้านไวรัสของ ISG แต่ละรายการ แต่กลไกระดับโมเลกุลพื้นฐานของ ISG แต่ละอันยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดเป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไปว่าโปรตีนหลายชนิดมีปฏิกิริยากับไซโตไคน์ตั้งแต่หนึ่งตัวขึ้นไปเพื่อให้แน่ใจว่ามีฤทธิ์เต็มที่ ดังนั้น ISG ทั้งสองจะมีปฏิกิริยาโดยตรงหรือปฏิสัมพันธ์ของพวกมันจะถูกสื่อกลางโดยโปรตีนในเซลล์ตัวอย่างเช่น การศึกษาโปรตีโอมิกส์ที่เชื่อมโยงด้วยแสงเมื่อเร็วๆ นี้ระบุว่า ATPase VCP/p97 เป็นคู่ปฏิสัมพันธ์ที่สำคัญของ IFITM3 ซึ่งการยับยั้งนำไปสู่ข้อบกพร่องในการคัดแยกไลโซโซม การหมุนเวียน และการขนส่งร่วมของ IFITM3 ด้วยอนุภาคไวรัส 14ด้วยการใช้การกระตุ้นภูมิคุ้มกัน เราระบุ VAPA ซึ่งเป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับถุงน้ำ ในฐานะคู่ปฏิสัมพันธ์กับ IFITM1/2/3 ที่เป็นสื่อกลางในการสุกของไวรัสที่มีโคเลสเตอรอลเป็นสื่อกลาง และสิ่งนี้ได้รับการยืนยันโดยการศึกษาอื่นโดยใช้ระบบยีสต์สองไฮบริดการสนับสนุนทางวิทยาศาสตร์ 15 , 16 .
กระบวนการทางชีววิทยาพื้นฐานที่เกี่ยวข้องกับการปราบปรามการติดเชื้อและการเปลี่ยนแปลงของเนื้อร้ายคือการนำเสนอแอนติเจน ซึ่งเป็นสื่อกลางโดยโมเลกุลหลักที่มีความเข้ากันได้ทางจุลพยาธิวิทยา (MHC)เปปไทด์ (กรดอะมิโนยาว 8-12 ตัว) จากโปรตีนที่แยกออกก่อนกำหนดหรือพับผิดจะถูกโหลดลงในเฮเทอโรไดเมอร์ MHC-I (ประกอบด้วยสายโซ่หนักและสายเบาของ MHC-I เรียกว่า β-2-microglobulin; β2M) 17,18เล็มเมอร์ MHC-I ที่เสถียรที่ได้ผลลัพธ์จะถูกส่งไปยังพื้นผิวเซลล์ โดยที่พวกมันนำเสนอเปปไทด์ในเซลล์ไปยังเซลล์ CD8+ (ทีเซลล์ที่เป็นพิษต่อเซลล์)ทีเซลล์รับรู้และทำลายเชื้อโรคเหล่านี้และเซลล์ที่มีแอนติเจนจำเพาะต่อเนื้องอกด้วยเหตุนี้ เชื้อโรคและเซลล์เนื้องอกจึงมักระงับกระบวนการนำเสนอแอนติเจนเพื่อหลีกเลี่ยงการเฝ้าระวังภูมิคุ้มกันนอกจากนี้ MHC-I ยังถูกควบคุมใน 40-90% ของเนื้องอกในมนุษย์ และมักจะเกี่ยวข้องกับการพยากรณ์โรคที่แย่ลง
ยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อเชื้อโรคจะต้องสลับระหว่างสถานะพักและสถานะการถอดรหัสอย่างรวดเร็วดังนั้นจึงมีการตั้งสมมติฐานว่าโปรตีนในเซลล์หลายชนิดมีส่วนร่วมในการตอบสนองต่อความต้องการ IFN สูงในช่วงเวลาสั้น ๆ รวมถึงการเปลี่ยนแปลงและการดัดแปลงโปรโมเตอร์โครมาติน 20,21การศึกษาส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่การระบุคู่โปรตีน ISG แต่ละรายการต่อหน้า IFNการศึกษาโปรตีโอมิกและการถอดเสียงหลายครั้งในระบบเซลล์แบบจำลองได้อธิบายผลกระทบของ IFN ที่มีต่อภูมิทัศน์ของเซลล์อย่างไรก็ตาม แม้จะมีความเข้าใจเพิ่มขึ้นเกี่ยวกับพลวัตที่เกิดจากอินเตอร์เฟอรอน แต่เราก็ยังรู้เพียงเล็กน้อยเกี่ยวกับการมีส่วนร่วมของ ISGเมื่อพิจารณาถึงความซับซ้อนและไดนามิกที่ขึ้นอยู่กับเวลาของการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอน มีคำถามสองข้อเกิดขึ้น: (i) เป็นไปได้ไหมที่จะรักษาเสถียรภาพและดักจับคอมเพล็กซ์มัลติโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณที่รวดเร็ว และ (ii) ปฏิสัมพันธ์เหล่านี้สามารถแมปลงในพื้นที่ 3 มิติได้หรือไม่
เพื่อแก้ไขปัญหาเหล่านี้ เราได้นำการเชื่อมโยงข้ามทางเคมี (DSS) ที่ใช้สื่อกลางแบบ disuccinimide ควบคู่ไปกับแมสสเปกโตรมิเตอร์ (CLMS) เพื่อศึกษาเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนที่เกิดจากIFNαและพลวัตของมันDSS เพิ่มพันธะโควาเลนต์ระหว่างเรซิดิวใกล้เคียงของโปรตีนและ/หรือโปรตีนเชิงซ้อน ภายในร่างกายการวิเคราะห์ MS ภายหลังเผยให้เห็นตำแหน่งการเชื่อมขวางเฉพาะที่สะท้อนถึงความใกล้ชิดเชิงพื้นที่ของบริเวณต่างๆ ภายในโปรตีนชนิดใดชนิดหนึ่ง เรียกว่าการเชื่อมโยงภายใน หรือหน่วยย่อยในโปรตีนเชิงซ้อน เรียกว่าความสัมพันธ์ระหว่างกันเมื่อใช้วิธีการนี้ เราได้ระบุคอมเพล็กซ์โปรตีนและโปรตีนใหม่ ๆ หลายชนิด รวมถึงเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนหลายตัวที่เกิดจากอินเตอร์เฟอรอนโดยการทดสอบชุดย่อยของการโต้ตอบใหม่เหล่านี้เพิ่มเติม เราแสดงให้เห็นว่า H2BFS (FS ฮิสโตนชนิด H2B; ซึ่งต่อไปนี้จะเรียกว่า H2B) และ MDN1 ทำหน้าที่เป็นหุ้นส่วนที่มีผลผูกพันสำหรับ HLA-A
เซลล์ Flo-1 เป็นหนึ่งในเซลล์มะเร็งของต่อมหลอดอาหารที่รู้จักกันดีในหลอดทดลอง เนื่องจากพวกมันเลียนแบบลักษณะสำคัญของเนื้องอกในหลอดอาหารอย่างไรก็ตาม ไม่ใช่ทุกเนื้องอกที่จะสร้างภูมิคุ้มกันได้ และเพื่อตรวจสอบว่าเซลล์ Flo-1 ตอบสนองต่อการรักษาด้วยอินเตอร์เฟอรอนหรือไม่ เราได้ทำการรักษาเซลล์ Flo-1 ด้วย IFNα 10 ng/ml เป็นเวลา 72 ชั่วโมงเซลล์ Flo-1 แสดงการเหนี่ยวนำในช่วงต้นของ pSTAT1 และ IRF1 โดยเริ่มต้น 2 ชั่วโมงหลังการบำบัดและดำเนินต่อไปเป็นเวลา 72 ชั่วโมง โดยมีการลดลงตามเวลาที่ระดับคงที่ของ IRF1 (รูปที่ 1A)พบว่า ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 และ ISG15) ถูกชักนำอย่างรุนแรงหลังจากผ่านไป 6 ชั่วโมง โดยเลียนแบบการตอบสนองในระยะกลางและปลายแบบคลาสสิกต่อIFNα (รูปที่ 1A)ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแบบจำลองเซลลูลาร์นี้สามารถใช้เพื่อศึกษาการตอบสนองของอินเตอร์เฟอรอนได้
การตอบสนองการแสดงออกของโปรตีนที่แตกต่างในเซลล์ Flo-1 หลังการรักษาIFNα( A ) การแสดงออกของโปรตีนในเซลล์ Flo-1 ที่รักษาด้วย IFNα 10 ng / ml เป็นเวลา 2, 6, 24, 48 และ 72 ชั่วโมงได้รับการวิเคราะห์โดยอิมมูโนลอตโดยใช้แอนติบอดี ISG ที่ระบุ( B ) เจล SDS-PAGE ย้อมสีน้ำเงิน Coomassie ของสารสกัดทั้งเซลล์หลังจากการเชื่อมโยงข้ามกับ DSS ตามเวลาและความเข้มข้นที่ระบุ(C) อิมมูโนลอตที่เป็นตัวแทนตรวจสอบด้วยแอนติบอดี p53(DO-1) จากตัวอย่างเดียวกันเพื่อประเมินระดับของการเชื่อมโยงข้ามโปรตีน
เพื่อจับภาพภูมิทัศน์อันตรกิริยาของโปรตีน ในแหล่งกำเนิด เราใช้ DSS ซึ่งเป็นสารเชื่อมโยงข้ามที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย เนื่องจากการซึมผ่านของเมมเบรนสูงและเวลาปฏิกิริยาค่อนข้างสั้นเวลาปฏิกิริยาที่สั้นลงช่วยป้องกันการก่อรูปของการรวมกลุ่มขนาดใหญ่ของโปรตีนที่ถูกเชื่อมโยงข้าม ดังนั้นจึงรักษาความคงตัวของตัวเชื่อมขวางไว้เพื่อกำหนดความเข้มข้น DSS ที่เหมาะสมที่สุดและหลีกเลี่ยงการเชื่อมโยงข้าม ขั้นแรกเราได้เปิดเผยเซลล์ไปที่ 5, 2.5 และ 1 mM DSS เป็นเวลา 5, 10, 5 และ 30 นาที ตามลำดับ และวิเคราะห์ไลซีนโดย SDS-PAGE ที่ย้อมด้วย Coomassie (ไม่แสดงข้อมูล) .ดูเหมือนว่าเซลล์ไลซีนจะมีการเชื่อมโยงข้ามอย่างมากที่ความเข้มข้นต่ำสุดและที่จุดเวลาที่สั้นที่สุดดังนั้น DSS จึงถูกไตเตรตไปที่ 1, 0.5 และ 0.1 มิลลิโมลาร์ ตลอด 5 นาที (รูปที่ 1B)การเชื่อมขวางที่เหมาะสมที่สุดถูกสังเกตด้วย DSS 0.5 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 5 นาที และสภาวะเหล่านี้ถูกเลือกสำหรับเซลล์ที่บำบัดด้วย IFNαนอกจากนี้ รูปที่ 1C แสดงเวสเทิร์นบล็อตที่ดำเนินการโดยใช้แอนติบอดี p53 (DO-1) เพื่อประเมินระดับของการเชื่อมโยงข้ามโปรตีน
เซลล์ Flo-1 ถูกบำบัดด้วย IFNα 10 นาโนกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนที่จะเติมตัวเชื่อมโยงข้ามเซลล์ที่เชื่อมโยงข้ามนั้นถูก lysed ในเวลาต่อมาโดยโปรตีโอไลซิสสองขั้นตอนและโปรตีนถูกประมวลผลโดย FASP (รูปที่ 2) 24, 25วิเคราะห์เปปไทด์ทริปติกแบบเชื่อมโยงข้ามโดยแมสสเปกโตรเมทรี (รูปที่ 2)จากนั้นสเปกตรัม MS/MS จะถูกจับคู่กับลำดับโปรตีนและหาปริมาณด้วย MaxQuant26,27เปปไทด์ที่เชื่อมโยงข้ามถูกระบุจากสเปกตรัมที่ได้รับโดยใช้โปรแกรม SIM-XL และสารประกอบแต่ละตัวถูกรวมเข้ากับเครือข่ายที่ซับซ้อนโดยใช้ไปป์ไลน์ซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์โอเพ่นซอร์ส xQuest28 และ SIM-XL29 (รูปที่ 2)SIM-XL ระบุอันตรกิริยาระหว่างโปรตีน-โปรตีน สายโซ่ภายใน และสายโซ่แต่ละสายในส่วนผสมโปรตีนแบบง่ายหรือซับซ้อน และจัดเตรียมสคริปต์สำหรับการแสดงภาพปฏิสัมพันธ์ในโครงสร้างโปรตีนนอกจากนี้ ยังจัดอันดับการอ้างอิงโยงแต่ละรายการเป็นคะแนน ID ตามคุณภาพสเปกตรัม MS/MS29มีการระบุปฏิสัมพันธ์และคอมเพล็กซ์โปรตีนและโปรตีนที่เชื่อถือได้สูงหลายอย่าง และมีการตรวจสอบปฏิสัมพันธ์ชุดใหม่เพิ่มเติมโดยใช้การตกตะกอนร่วมของภูมิคุ้มกันและการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของคอมเพล็กซ์โดยใช้การสร้างแบบจำลองโมเลกุลไดนามิก (MD) (รูปที่ 2) 30, 31
ภาพรวมแผนผังของวิธี CLMSเซลล์ Flo-1 ได้รับการบำบัดด้วย IFNα 10 นาโนกรัม/มิลลิลิตรเป็นเวลา 24 ชั่วโมงตามด้วยการเชื่อมโยงข้ามโปรตีน ในแหล่งกำเนิด โดยใช้ DSS ตามด้วยการสลายเซลล์และทริปซิไนเซชันตัวอย่างที่เชื่อมโยงข้ามถูกวิเคราะห์โดยใช้เครื่องสเปกโตรมิเตอร์ Orbitrap และเก็บตัวอย่างเพิ่มเติมสำหรับการแตกตัวของสารตั้งต้นของเปปไทด์ในระหว่าง LC-MS/MSเปปไทด์ที่เชื่อมโยงกันสองตัวถูกระบุจากสเปกตรัมที่ได้รับโดยใช้เครื่องจดจำสเปกตรัมของโปรแกรมเปปไทด์แบบเชื่อมโยงข้าม (SIM-XL) และสารประกอบทั้งหมดถูกรวมเข้าด้วยกันเป็นเครือข่ายที่ซับซ้อนโดยใช้ไปป์ไลน์การคำนวณกรองการโต้ตอบที่มีความเชื่อมั่นต่ำออกตามคะแนนอัตราผลบวกลวง (FDR)ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีนความเที่ยงตรงสูงใหม่หลายครั้งได้รับการยืนยันเพิ่มเติมโดยใช้การตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันร่วม และตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในสารเชิงซ้อนโดยใช้แบบจำลองพลวัตของโมเลกุล (MD)
ตรวจพบเปปไทด์ทั้งหมด ~ 30,500 และ ~ 28,500 โดยใช้ MaxQuant ในตัวอย่างIFNαที่ไม่ถูกกระตุ้นและกระตุ้นตามลำดับ (ตารางเสริม S1, รูปที่ 3A)การกระจายความยาวของเปปไทด์ในทั้งสองกรณีแสดงสัดส่วนที่สูงกว่าของเปปไทด์ที่มีขนาดใหญ่กว่า ซึ่งบ่งชี้ว่ามีเปปไทด์เชื่อมโยงข้าม (รูปที่ 3B, C)นอกจากนี้ยังมีสัดส่วนที่มากขึ้นของเปปไทด์ที่มีขนาดใหญ่ขึ้นในช่วง 40–55 ในตัวอย่างที่ได้รับIFNα (รูปที่ 3C)การทำแผนที่โปรตีนเทียบกับความเข้มของ log2 แสดงให้เห็นว่าโปรตีนที่กระตุ้นอินเตอร์เฟอรอนแบบคลาสสิกมีปริมาณมากที่สุดเมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่บำบัด ซึ่งรวมถึง MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 และ HLA-F (รูปที่ 3D)การวิเคราะห์วิถีสำหรับโปรตีนที่ได้รับการเสริมสมรรถนะมากกว่าสามเท่าเพื่อตอบสนองต่อการบำบัดด้วย IFNα โดยใช้ฐานข้อมูลวิถีของ Reactome แสดงให้เห็นว่าการนำเสนอและการประมวลผลแอนติเจนที่ใช้ MHC-I เป็นสื่อกลางเป็นวิถีทางที่โดดเด่นที่สุด (รูปที่ 3E)สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ การตอบสนองของไวรัสที่สื่อกลางโดย OAS และ ISG15 รวมถึงการส่งสัญญาณIFNα/β และการส่งสัญญาณไซโตไคน์อยู่ในวิถีทางที่เปิดใช้งานนอกจากนี้ การเชื่อมโยงข้ามโปรตีนที่จำเพาะต่อไลซีนและซีรีนถูกระบุจากสเปกตรัม MS/MS ที่ได้มาแต่แรกโดยใช้ SIM-XLการศึกษาล่าสุดรายงานว่า ISG 104 ISG ครอบคลุมไวรัส 20 ตัวจาก 9 คลาสไวรัสโดยการวิเคราะห์เมตาของการศึกษาการแสดงออกมากเกินไปของ ISG แต่ละรายการใน 5 เซลล์ประเภท 9อย่างไรก็ตาม เพื่อเอาชนะข้อจำกัดในการคำนวณของการคัดกรองชุดข้อมูลขนาดใหญ่ เราเริ่มต้นด้วยชุดข้อมูลขนาดเล็กเพื่อสำรวจการโต้ตอบที่เป็นไปได้ระหว่างรายการยีน IRDS ที่รายงานโดย Padaria และคณะ ซึ่งส่วนใหญ่เป็น ISG
การจำแนกโปรตีนเชื่อมโยงข้ามที่แสดงออกแตกต่างกันเพื่อตอบสนองต่อIFNα (ข้อมูลที่ได้รับจาก MaxQuant)( A ) แผนภาพเวนน์แสดงจำนวนของเปปไทด์ทั่วไปและเปปไทด์พิเศษที่ระบุในตัวอย่าง Flo-1 ที่ได้รับการบำบัดและไม่ผ่านการบำบัดIFNα14การกระจายความยาวเปปไทด์ของตัวอย่างเชื่อมขวางที่ไม่ได้รับการบำบัด (B) และ IFNα (C)(D) แผนที่ความร้อนที่แสดงถึง log2 (ความเข้มของ LFQ) ระหว่างเซลล์ Flo-1 ที่ไม่ได้รับการรักษาและIFNα14ที่ได้รับการบำบัดแผงด้านซ้ายแสดงโปรตีนที่ถูกกระตุ้นมากที่สุดเมื่อมีIFNα(E) ฮิสโตแกรมแสดงถึงเส้นทางการเสริมสมรรถนะหลัก 20 เส้นทางหลังการรักษาIFNαฐานข้อมูลวิถี Reactome วิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงมากกว่าสี่เท่าในโปรตีนที่ตอบสนองต่อIFNαที่ได้รับการควบคุม
การกระตุ้น ISG ที่ใช้อินเตอร์เฟอรอนเป็นสื่อกลางได้รับการบันทึกไว้อย่างดี แต่ในระดับโมเลกุล ยังไม่ค่อยเข้าใจว่าทำไมโปรตีนเหล่านี้ถึงจุดสูงสุดในการทำงานทางชีววิทยาที่หลากหลายเราตรวจสอบปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนด้วยความมั่นใจในระดับสูงระหว่าง ISG ที่รู้จักสิ่งที่น่าสนใจคือเราระบุเครือข่ายรวมถึงโปรตีน MX1, USP18, ROBO1, OAS3 และ STAT1 ที่ก่อตัวเป็นคอมเพล็กซ์ขนาดใหญ่เพื่อตอบสนองต่อการรักษาIFNα (รูปที่ 4, ตาราง S2) 32,33,34สิ่งสำคัญที่สุดคือ ปฏิกิริยาเหล่านี้พบใน triplicates ทั้งหมดที่รักษาด้วย IFNα และไม่พบในตัวอย่างที่ไม่ได้รับการบำบัด ซึ่งบอกเป็นนัยว่าพวกมันถูกสร้างขึ้นโดยเฉพาะเพื่อตอบสนองต่อการรักษา IFNαเป็นที่ทราบกันดีว่า STAT1 ควบคุมการแสดงออกของ ISG เหล่านี้ด้วยการถอดเสียง แต่ไม่ได้มีการศึกษาปฏิสัมพันธ์กับ ISG ในระดับโปรตีนโครงสร้างผลึกของ STAT1 แสดงให้เห็นว่าโดเมนขดลวด (CCD) ไม่เกี่ยวข้องกับการโต้ตอบกับ DNA หรือโปรโตเมอร์ในระหว่างการก่อตัวของไดเมอร์α-helices เหล่านี้สร้างโครงสร้างเกลียวเกลียวที่ให้พื้นที่ผิวที่ชอบน้ำเป็นส่วนใหญ่เพื่อให้ปฏิกิริยาโต้ตอบเกิดขึ้น 35ในข้อมูล CLMS ของเรา เราสังเกตว่าการโต้ตอบกับ STAT1 ส่วนใหญ่เกิดขึ้นในโดเมน SH2 ที่อยู่ก่อนหน้า CCD, โดเมนตัวเชื่อมโยง หรือส่วนท้ายของเทอร์มินัล C (สารตกค้าง 700-708) (รูปที่ 4A)การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่า USP18 เชื่อมโยงกับ CCD และโดเมนที่มีผลผูกพันกับ DNA (DBD) ของ STAT2 และได้รับคัดเลือกไปยังหน่วยย่อยของตัวรับอินเตอร์เฟอรอนประเภท I IFNAR2 เพื่อเป็นสื่อกลางในการยับยั้งการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอนประเภท I 24ข้อมูลของเรายังแสดงให้เห็นว่าโดเมนตัวเร่งปฏิกิริยา USP18 โต้ตอบกับ STAT1 DBD (รูปที่ 4A, D) ซึ่งบ่งชี้ว่าทั้ง STAT1 และ STAT2 อาจมีบทบาทในการดึงดูด USP18 สู่ IFNAR2
เครือข่าย ISG โปรตีน-โปรตีนที่ระบุในเซลล์เชื่อมโยงข้ามที่บำบัดด้วยIFNα( A ) พล็อตปฏิสัมพันธ์ 2 มิติที่แสดงปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีน (สร้างในโปรแกรม SIM-XL) โดยมีเส้นที่แสดงถึงปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุล (ตั้งค่าการตัดครอสลิงก์เป็น 3.5)โดเมนที่มีตัวตนต่างกันจะถูกทำเครื่องหมายด้วยสี 32: โดเมน MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) และ GED (569–660)โดเมน OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) และ OAS1_C (903-108)โดเมน ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) และ fn3 (777–864)ฟิลด์ STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) และ STAT1_TAZ2bind (715–739)( B ) โปรแกรมดูแบบวงกลมของโปรตีนเชื่อมโยงข้าม (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 และ STAT1) โดยมีปฏิสัมพันธ์และปฏิสัมพันธ์ที่มีป้ายกำกับเป็นสีน้ำเงินและสีแดงตามลำดับเกณฑ์การเชื่อมโยงข้ามถูกตั้งไว้ที่ 3.5พล็อตจุดระบุไซต์โต้ตอบ STAT1 ที่มี MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) และ OAS3 (F) รวมถึงไซต์โต้ตอบ K หรือ S ระหว่างเปปไทด์ทั้งสองในรูป เกณฑ์คะแนน cross-link ถูกกำหนดไว้ที่ 3.0( G ) ไซต์โต้ตอบต่างๆ ระหว่างโดเมน STAT1 และ OAS3 DI ซ้อนทับบนโครงสร้างโปรตีนใน PyMol (ระบบกราฟิกโมเลกุล PyMOL เวอร์ชัน 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) และ OAS3 (pdb id: 4s3n34)) โปรแกรม.
มีการอธิบายไอโซฟอร์มของ USP18 สองแบบในมนุษย์ ได้แก่ โปรตีนความยาวเต็มซึ่งส่วนใหญ่อยู่ในนิวเคลียส และไอโซฟอร์มที่ไม่มีโดเมนที่ปลาย N คือ USP18-sf ซึ่งมีการกระจายอย่างเท่าเทียมกันในไซโตพลาสซึมและนิวเคลียส 36นอกจากนี้ ปลาย N ถูกคาดการณ์ว่าไม่มีโครงสร้างและไม่ต้องการกิจกรรมของไอโซเพปทิเดสหรือการจับ ISG1537ปฏิสัมพันธ์ส่วนใหญ่ที่ระบุในการศึกษาของเราตั้งอยู่ที่ N-terminus ของโปรตีน โดยบอกว่าปฏิกิริยาเหล่านี้เกี่ยวข้องกับ USP18 แบบเต็มความยาว (รูปที่ 4A, D) และอาจเกิดขึ้นในนิวเคลียสนอกจากนี้ ข้อมูลของเรายังระบุด้วยว่า N-terminus นั้นมีความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีนตำแหน่งการจับ IFNAR2 ตั้งอยู่ระหว่างสารตกค้าง 312-368 และที่สำคัญไม่มีโปรตีนใดในคอมเพล็กซ์จับกับบริเวณนี้ (รูปที่ 4A) 37,38ข้อมูลเหล่านี้ที่นำมารวมกันบ่งชี้ว่าโดเมนการจับ IFNAR2 ถูกใช้โดยโปรตีนของตัวรับเพียงอย่างเดียวนอกจากนี้ พบว่ามีเพียง OAS3 และ ROBO1 เท่านั้นที่เชื่อมโยงกับโดเมนต้นทางของไซต์ที่มีผลผูกพัน N-terminus และ IFNAR2 (รูปที่ 4A)
ROBO1 เป็นของอิมมูโนโกลบุลิน (Ig) ซูเปอร์แฟมิลี่ของโมเลกุลส่งสัญญาณของเมมเบรน และประกอบด้วยโดเมน Ig ห้าโดเมนและโดเมนไฟโบรเนคติน (Fn) สามโดเมนในภูมิภาคนอกเซลล์โดเมนนอกเซลล์เหล่านี้ตามมาด้วยบริเวณเมมเบรนใกล้เคียงและเกลียวเมมเบรนเดี่ยว 39 ภูมิภาคภายในเซลล์ที่ไม่มีโครงสร้างตั้งอยู่ที่ปลาย C และมีลวดลายลำดับที่อนุรักษ์ไว้ซึ่งเป็นสื่อกลางในการจับโปรตีนเอฟเฟกต์เตอร์บริเวณที่ขยายจากกรดอะมิโน ~1100 ถึง 1600 ส่วนใหญ่จะไม่เป็นระเบียบเราพบว่า MX1 โต้ตอบกับ ROBO1 ผ่าน Ig, Fn และโดเมนภายในเซลล์ ในขณะที่การโต้ตอบกับ STAT1 ส่วนใหญ่เกิดขึ้นระหว่าง CCD, โดเมนตัวเชื่อมโยง และ C-terminus ของ ROBO1 (รูปที่ 4A, E)ในทางกลับกัน การโต้ตอบกับบริเวณตัวเชื่อมโยง DI, DIII และ OAS3 ถูกกระจายไปทั่วโปรตีน ROBO1 (รูปที่ 4A)
ตระกูลโปรตีน oligoadenylate synthase (OAS) ยอมรับและจับ RNA (dsRNA) ที่มีเกลียวคู่ภายในเซลล์ ผ่านการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง และสังเคราะห์ oligoadenylates ที่เชื่อมโยง 2′, 5′ (2-5 As) 40พบว่าในบรรดา OAS ทั้งสาม OAS3 แสดงความสัมพันธ์สูงสุดสำหรับ dsRNA และสังเคราะห์จำนวน 2-5 As น้อยที่สุด ซึ่งสามารถกระตุ้น RNase L และด้วยเหตุนี้จึงจำกัดการจำลองแบบของไวรัส 41ตระกูล OAS ประกอบด้วยโดเมนการถ่ายโอนนิวคลีโอไทด์ที่มีลักษณะคล้ายโพลีเมอเรสเบตา (pol-β)การวิจัยก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของโดเมนเทอร์มินัล C (DIII) ขึ้นอยู่กับโดเมนที่มีผลผูกพัน dsRNA (DI) ซึ่งจำเป็นสำหรับการเปิดใช้งาน OAS342เราสังเกตว่าโดเมน DI และ DII ของ OAS3 โต้ตอบกับ CCD และบริเวณทางแยกเล็ก ๆ ระหว่าง SH2 และ STAT1 TAD (รูปที่ 4A, F)การซ้อนทับไซต์การเชื่อมขวางที่แตกต่างกันบนโครงสร้างโปรตีนเผยให้เห็นการทำงานร่วมกันระหว่าง β-sheet และลูป DBD STAT1 และช่องเปิดหรือช่องที่เกิดจากสารตกค้าง 60–75 ในโดเมน DI ของ OAS3 (รูปที่ 4G)การวางแนวของโปรตีนในคอมเพล็กซ์ยังบ่งชี้ว่าไม่มีการโต้ตอบกับ OAS3 ใด ๆ ที่รบกวนความสามารถในการจับกับ DNA ของโดเมน DI (รูปที่ S1A)นอกจากนี้โดเมน N-terminal ของ GTPase MX1 ยังโต้ตอบอย่างกว้างขวางกับโดเมน DI และ DIII ของ OAS3 (รูปที่ 4A)นอกจากนี้เรายังสังเกตการทำงานร่วมกันระหว่าง OAS1 และ MX1 ในการทำซ้ำที่ได้รับการรักษาด้วยIFNαทั้งสามรายการ โดยที่โดเมน OAS1 เดียว (ยังทำงานแบบเร่งปฏิกิริยาด้วย) โต้ตอบกับโดเมน MX1 ทั้งสามโดเมน (รูปที่ S2A, B)
โปรตีน MX เป็นส่วนหนึ่งของตระกูลใหญ่ของ GTPases ที่มีลักษณะคล้ายไดนีนซึ่งมีโดเมน GTPase ที่ปลาย N ซึ่งจับและไฮโดรไลซ์ GTP ซึ่งเป็นโดเมนระดับกลางที่เป็นสื่อกลางในการประกอบตัวเอง และซิปลิวซีนที่ปลาย C ที่ทำหน้าที่เป็น GTPase (LZ ).โดเมนเอฟเฟกเตอร์โดเมน25,43MX1 จับกับหน่วยย่อยของโพลีเมอเรสของไวรัสเพื่อป้องกันการถอดรหัสยีนของไวรัสหน้าจอไฮบริดสองยีสต์ที่รายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า MX1 ที่เกี่ยวข้องกับ PIAS1 ยับยั้งการกระตุ้นการทำงานของยีนที่ใช้สื่อกลาง STAT1 โดยการปิดกั้นกิจกรรมการจับกับ DNA และยังมีกิจกรรม SUMO E344,45 ligaseที่นี่เราแสดงให้เห็นว่า MX1 ผูกกับ STAT1 (รูปที่ 4C, D) อย่างไรก็ตามปฏิสัมพันธ์นี้ส่งผลต่อการกระตุ้นการทำงานของยีนที่ใช้สื่อกลาง STAT1 เพื่อตอบสนองต่อIFNαที่ต้องการการศึกษาเพิ่มเติมอย่างไรนอกจากนี้ เรายังพบว่า MX1 โต้ตอบกับ IFIT3 และ DDX60 ในการทำซ้ำที่ได้รับการรักษาด้วยIFNαทั้งสามรายการ (รูปที่ S2C)
DDX60 เป็นเฮลิเคสของไซโตพลาสซึมที่เกิดจาก IFN ซึ่งก่อนหน้านี้มีรายงานว่ามีบทบาทในการย่อยสลาย RNA46 ของไวรัสโดยไม่ขึ้นกับ RIG-Iมันโต้ตอบกับ RIG-I และเปิดใช้งานการส่งสัญญาณในลักษณะเฉพาะลิแกนด์ 46 DDX60 ประกอบด้วยโดเมนเฮลิเคส DEXD/H-Box และโดเมนเฮลิเคสที่เทอร์มินัล C ที่ผูก RNA ของไวรัสและ DNA47การโต้ตอบส่วนใหญ่กับ MX1 และ IFIT3 เกิดขึ้นภายในภูมิภาค N- และ C-terminal ที่ยาวโดยไม่มีโดเมนหรือลวดลายที่เป็นที่ยอมรับ (รูปที่ S2E, F)อย่างไรก็ตาม MX1 ยังเชื่อมโยงกับโดเมนเฮลิเคส DEXD/H-Box (รูปที่ S2E)โปรตีนในตระกูล IFIT มีสำเนาที่เรียงตามกันของรูปแบบเกลียว-เลี้ยว-เกลียวที่โดดเด่นที่เรียกว่าการทำซ้ำเตตราเปปไทด์ (TPR)พบว่า IFIT3 เป็นตัวดัดแปลงเชิงบวกของการส่งสัญญาณ RIG-I และด้วยเหตุนี้จึงเป็นส่วนประกอบของ MAVS complexเมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลของเราแนะนำว่า IFIT3 และ DDX60 มีปฏิสัมพันธ์เป็นหลักในภูมิภาคระหว่าง TPR 3–6 ของ IFIT3 และอาจมีบทบาทในการส่งสัญญาณ RIG-I / MAVS (รูปที่ S2F)
เนื่องจากการคัดกรองโปรตีโอมทั้งหมดนั้นใช้การคำนวณอย่างเข้มข้น เราจึงคัดกรองฐานข้อมูล UniProt ของมนุษย์ทั้งหมดเพื่อดูว่ามีหนึ่งใน IFNα ที่ทำซ้ำหรือไม่ในแบบจำลองนี้ เราพบเครือข่ายโต้ตอบที่มีความน่าเชื่อถือสูงหลายเครือข่ายสำหรับ HLA-Aการวิเคราะห์วิถีทางโปรตีนที่ระบุโดยสเปกตรัม MS/MS แสดงให้เห็นว่าการประมวลผลและการนำเสนอแอนติเจนที่ใช้ MHC-I เป็นวิถีทางหลักที่เกิดจากอินเตอร์เฟอรอน (รูปที่ 3 มิติ)ดังนั้นเราจึงมุ่งเน้นไปที่การศึกษาปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนของโมเลกุล MHC-I ด้วยความมั่นใจในระดับสูงในตัวอย่างที่เชื่อมโยงข้ามทั้งหมดHLA ประกอบด้วยโดเมน α1, α2 และ α3 และสายโซ่เบา และไมโครโกลบูลิน β2 (β2m) เป็นโปรตีนพี่เลี้ยงคงที่เมื่อประกอบกันในเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม HLA จะไม่เสถียรหากไม่มีเปปไทด์ลิแกนด์ร่องที่ยึดเหนี่ยวเปปไทด์ถูกสร้างขึ้นโดยโดเมน α1 และ α2 ที่ไม่มีโครงสร้างซึ่งมีโพลีมอร์ฟิกสูงและไม่มีโครงสร้างสูงในรูปแบบที่ไม่ใช่เปปไทด์ และโดเมนโพลีมอร์ฟิก α351 ที่ค่อนข้างน้อยกว่าเมื่อมีIFNαเราตรวจพบคอมเพล็กซ์ HLA-A สองตัว: อันหนึ่งโต้ตอบกับ HMGA1 และ H2B (รูปที่ 5, ตาราง S3) และอีกอันโต้ตอบกับ MDN1, LRCH4 และ H2B (รูปที่ 6)
IFNα ชักนำให้เกิดเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ HLA-A กับ H2B (H2BFS) และ HMGA1(A) พล็อต 2D (สร้างในซอฟต์แวร์ SIM-XL) ที่แสดงการโต้ตอบประเภทต่าง ๆ ในคอมเพล็กซ์ H2B-HLA-A-HMGA1: ลิงก์ระหว่างกัน (สีน้ำเงิน) ลิงก์ระหว่างกัน (สีแดง) และลิงก์เดี่ยว (สีดำ).โดเมนของตัวตนที่แตกต่างกันนั้นมีรหัสสี 32: H2B (ฮิสโตน; 2–102) และ MHC-I (MHC_1; 25–203, กลุ่ม C1; 210–290 และ MHC_I_C; 337–364)เกณฑ์การเชื่อมโยงข้ามถูกตั้งไว้ที่ 3.5พล็อตจุดบ่งชี้ไซต์ปฏิสัมพันธ์ HLA-A กับ H2B (B) และ HMGA1 (C) รวมถึงไซต์ปฏิสัมพันธ์ K หรือ S ระหว่างเปปไทด์ทั้งสองในรูป เกณฑ์คะแนน cross-link ถูกกำหนดไว้ที่ 3.0(D) ความสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนที่แสดงในโครงสร้างของโปรตีน H2B, HLA-A และ HMGA1 ในโปรแกรม PyMOLโครงสร้างเหล่านี้สร้างแบบจำลองโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) และโครงสร้างเทมเพลตสำหรับโปรตีน H2B, HLA-A และ HMGA1 คือ 1kx552, 1kj349 และ 2eze55 ตามลำดับ
IFNα ทำให้เกิดเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ HLA-A กับ H2B (H2BFS), MDN1 และ LRCH4( A ) ครอสลิงก์ภายในโมเลกุล (สีแดง) และระหว่างโมเลกุล (สีน้ำเงิน) นำเสนอบนแผนที่โต้ตอบ 2 มิติ (สร้างในซอฟต์แวร์ SIM-XL) โดยมี MDN1 แสดงเป็นวงกลมเกณฑ์การเชื่อมโยงข้ามถูกตั้งไว้ที่ 3.5โดเมนของตัวตนที่แตกต่างกันนั้นมีรหัสสี 32: H2B (ฮิสโตน; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, กลุ่ม C1; 210–290 และ MHC_I_C; 337–364) และ LRCH4 (LRR_8 (68–126) LRR_8 (137–194) และ CH (535–641))(B) ความสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนที่แสดงในโครงสร้างของโปรตีน H2B, HLA-A, LRCH4 และ MDN1 ในโปรแกรม PyMOLโครงสร้างเหล่านี้สร้างแบบจำลองโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) พร้อมโครงสร้างเทมเพลต 1kx552, 1kj349, 6hlu62 และ 6i2665 สำหรับโปรตีน H2B, HLA-A, LRCH4 และ MDN1 ตามลำดับดอทพล็อตแสดงไซต์ปฏิสัมพันธ์ K หรือ S สำหรับ HLA-A ที่มี H2B (C), LRCH4 (D) และ MDN1 (E)สำหรับแปลง เกณฑ์คะแนนการเชื่อมโยงข้ามถูกตั้งค่าเป็น 3.0
นอกเหนือจากการรักษาความสมบูรณ์ของจีโนมแล้ว ฮิสโตน H2B ยังมีส่วนร่วมในการควบคุมการถอดรหัสอีกด้วยโปรตีน H2B ประกอบด้วยโดเมนฮิสโตนส่วนกลาง (HFD) ที่สร้างโดย α-เอนริเก้สามตัวที่แยกจากกันด้วยลูปและส่วนหางของปลาย C 41,52การโต้ตอบกับ H2B ส่วนใหญ่เกิดขึ้นใน α1 helix ซึ่งให้การตัดแต่งด้วยเฮเทอโรไดเมอร์ HFD (รูปที่ 5A, B)แม้ว่าไลซินจะเกี่ยวข้องกับการจับกับดีเอ็นเอ แต่ไลซินบางชนิดก็เป็นแหล่งอะซิติเลชั่นหรือเมทิลเลชันทางเลือกอีกด้วยตัวอย่างเช่น สารตกค้าง K43, K46 และ K57 จาก H2B ไม่เกี่ยวข้องกับการจับ DNA โดยตรง แต่เป็นเป้าหมายของการดัดแปลงหลังการถอดรหัสต่างๆ53ในทำนองเดียวกัน สารตกค้าง K44, K47 และ K57 ใน H2B อาจมีบทบาททางเลือกเมื่อมีIFNα รวมถึงอันตรกิริยากับโปรตีนอื่น ๆ (รูปที่ 5A, B)นอกจากนี้ ฮิสโตน H2B ที่อยู่นอกโครโมโซมยังกระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในเซลล์ประเภทต่างๆ โดยทำหน้าที่เป็นเซ็นเซอร์ไซโตซิลิกเพื่อตรวจจับชิ้นส่วน DNA ที่มีเกลียวคู่ (dsDNA) ที่ได้มาจากสารติดเชื้อหรือเซลล์ที่เสียหายในการปรากฏตัวของไวรัส DNA การสูญเสีย H2B จะยับยั้งการผลิต IFN-βและ STAT154 phosphorylationเป็นที่รู้กันว่า H2B เคลื่อนที่เข้าและออกจากนิวเคลียสได้เร็วกว่าฮิสโตนแกนอื่นๆ54การโต้ตอบของ H2B กับ MDN1 และ LRCH4 ยังถูกพบในตัวอย่างที่ไม่ผ่านการบำบัดที่เลือกไว้อีกด้วยเราพบว่า HLA-A มีปฏิกิริยากับ H2B ในตัวอย่างที่ได้รับการรักษาด้วยIFNαทั้งสามตัวอย่าง และในตัวอย่างซ้ำที่ไม่ผ่านการบำบัดหนึ่งตัวอย่างข้อมูลเหล่านี้สะท้อนถึงบทบาทของ H2B ในการทำงานทางสรีรวิทยาทางเลือกที่ไม่ขึ้นอยู่กับการควบคุมการถอดเสียง
HMGA1 (กลุ่มที่มีความคล่องตัวสูง AT-Hook 1) ซึ่งเป็นนิวคลีโอโปรตีนขนาดเล็กที่อุดมไปด้วยกรดอะมิโนที่ส่งเสริมโรค ได้รับการระบุร่วมกับ HLA-Aมันมีหางที่ปลายขั้ว C ที่เป็นกรดและมี DBD ที่แตกต่างกันสามอันที่เรียกว่าตะขอ AT เนื่องจากพวกมันจับกับร่องเล็ก ๆ ของบริเวณที่มี AT มากใน dsDNA55,56การจับกันนี้ทำให้ DNA โค้งงอหรือยืดตรง ทำให้ปัจจัยการถอดรหัสแบบบัญญัติสามารถเข้าถึงลำดับที่สอดคล้องกันได้เชื่อกันว่าหางของ C-terminal มีส่วนเกี่ยวข้องในปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีนและการสรรหาปัจจัยการถอดรหัส เนื่องจากการกลายพันธุ์ของการลบ C-terminal ไม่สามารถเริ่มการถอดรหัสได้ยิ่งไปกว่านั้น โดเมนนี้ยังมีไซต์ฟอสโฟรีเลชั่นที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้หลายแห่งซึ่งเป็นซับสเตรตที่รู้จักสำหรับไคเนส 58เราสังเกตการโต้ตอบของ HLA-A และ H2B กับ HMGA1 นอกโดเมน C-terminal โดยบอกว่าโดเมน C-terminal ส่วนใหญ่จะใช้สำหรับการเชื่อมโยงปัจจัยการถอดรหัส (รูปที่ 5A, C)โปรตีน HMGA แข่งขันกับฮิสโตน H1 เพื่อจับกับ DNA ของอะแดปเตอร์ ซึ่งจะเป็นการเพิ่มการเข้าถึง57ในทำนองเดียวกัน ดูเหมือนว่า HMGA จะทำอันตรกิริยากับฮิสโตน H2B ไปตาม DNA ตัวเชื่อมโยงเพื่อแข่งขันกับฮิสโตน H1HMGB1 กระตุ้นการแสดงออกของ HLA-A, -B และ -C ในเซลล์ dendritic ซึ่งนำไปสู่การเปิดใช้งาน แต่การทำงานร่วมกันระหว่าง HMG และ HLA ยังไม่ได้รับการรายงานก่อนหน้านี้เราพบว่า HMGA1 โต้ตอบกับโดเมน α1 และ α3 ของ HLA-A โดยมีการโต้ตอบส่วนใหญ่นอก 3 DBD (รูปที่ 5A, C)ในมือของเรา พบว่า HLA-A ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในนิวเคลียส (ไม่แสดงข้อมูล) และเนื่องจาก H2B และ HMGA1 มีอยู่ในนิวเคลียสด้วย ปฏิกิริยานี้น่าจะเกิดขึ้นในนิวเคลียสสารเสริมจำเพาะที่วัดระหว่าง H2B, HLA-A และ HMGA1 ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 5D
ปฏิกิริยาส่วนใหญ่ของ HLA-A กับโปรตีนอื่นเกิดขึ้นภายในโดเมน α1 และ α2 และโดเมน C-terminal ที่ไม่เป็นระเบียบ (รูปที่ 6)ในหนึ่งในตัวอย่างเหล่านี้ เราพบว่า HLA-A โต้ตอบกับส่วนหางของเทอร์มินัล N ที่ไม่เป็นระเบียบของ LRCH4 (รูปที่ 6A, D)LRCH4 ควบคุมการเปิดใช้งาน TLR4 และการเหนี่ยวนำไซโตไคน์ของ LPS ดังนั้นจึงปรับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ 60,61มันเป็นโปรตีนเมมเบรนที่มีการทำซ้ำที่อุดมไปด้วยลิวซีน (LRR) เก้าครั้งและมาตรฐานคล้ายคลึงกันของความสงบ (CH) ใน ectodomain ของมัน ตามด้วยโดเมนของทรานส์เมมเบรน (TMD) 60, 62มีการรายงานโดเมน CH เพื่อเป็นสื่อกลางในการโต้ตอบระหว่างโปรตีนและโปรตีน 60กรดอะมิโนที่ยืดออกประมาณ 300 ตัวระหว่างโดเมน LRR และ CH สามารถเข้าถึงได้ค่อนข้างมากแต่ไม่เป็นระเบียบจากการทำงานของภูมิภาคที่ไม่เป็นระเบียบในฐานะสื่อกลางของเครือข่ายโปรตีน - โปรตีนและการขนส่งตุ่ม เราพบว่าปฏิกิริยาของโปรตีนส่วนใหญ่เกิดขึ้นในบริเวณที่ไม่เป็นระเบียบการโต้ตอบกับ MDN1 ถูกกระจายตลอดความยาวของโปรตีน รวมถึงโดเมน LRR1, LRR6, CH และภูมิภาคสุ่ม ในขณะที่ H2B ผูกพันกับโดเมน CH เป็นหลัก (รูปที่ 6A, B)โดยเฉพาะอย่างยิ่งไม่มีการโต้ตอบใด ๆ ที่รวม TMJ ซึ่งแนะนำความจำเพาะของแนวทาง CLMS (รูปที่ 6A, B)
MDN1 ยังถูกระบุในฐานะส่วนหนึ่งของโครงข่ายโปรตีน HLA-A (รูปที่ 6A)มันเป็นของโปรตีนตระกูล AAA (ATPases ที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมต่างๆ)นี่คือโดเมน AAA ของเทอร์มินัล N เดียวกันกับที่จัดเป็นวงแหวนแบบเฮกซาเมอริก และลบปัจจัยการประกอบออกจากหน่วยย่อยไรโบโซม 60S 64ดูเหมือนจะคล้ายกับ dynein64,65,66นอกจากนี้ ภูมิภาคที่มี Asp/Glu มากจะตามมาด้วยโดเมน MIDAS (ไซต์ที่ขึ้นอยู่กับไอออนของโลหะ)เนื่องจาก MDN1 มีขนาดใหญ่ (ประมาณ 5,600 กรดอะมิโน) และความคล้ายคลึงที่จำกัดกับโปรตีนที่ได้รับการศึกษาเป็นอย่างดี จึงไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับโครงสร้างและการทำงานของมันในมนุษย์เราระบุ HLA-A, H2B และ LRCH4 เป็นพันธมิตรที่มีผลผูกพันกับ MDN1 และเปิดเผยการวางแนวของพวกมันเป็นโปรตีนเชิงซ้อนใน PyMol (รูปที่ 6A, B)โปรตีนทั้งสามชนิดนี้มีปฏิกิริยากับโดเมน AAA, โดเมนตัวเชื่อมโยงที่มีลักษณะคล้ายไดนีน และอาจเป็นโดเมน MIDAS MDN1ในรายงานก่อนหน้านี้ การทำให้บริสุทธิ์โดยความสัมพันธ์ของโปรตีนเหยื่อระบุว่า MDN1 เป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับฮิสโตน H2B67นอกจากนี้ การศึกษาล่าสุดยังรายงานปฏิสัมพันธ์ระหว่าง MDN และ HLA-B ในเซลล์ HCT116 โดยใช้แมสสเปกโตรมิเตอร์ที่มีความสัมพันธ์บริสุทธิ์ ซึ่งสนับสนุนการค้นพบของเราการระบุสารเชิงซ้อนนี้ในตัวอย่างที่ได้รับการรักษาด้วยIFNαแสดงให้เห็นบทบาทของ MDN1 ในการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอน
เนื่องจากยีน HLA มีความหลากหลายสูง เราจึงแยกลำดับการอ่านการแมป HLA-A, -B และ -C จากข้อมูลลำดับ RNA ของเซลล์ Flo-1 (ไม่แสดงข้อมูล)ลำดับเปปไทด์ที่สอดคล้องกับการอ่านการหาลำดับเผยให้เห็นความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่าง HLA-A, -B และ -C ในบริเวณที่เปปไทด์ที่ถูกเชื่อมโยงข้ามตั้งอยู่ใน HLA-A (รูปที่ S3)นอกจากนี้ เราไม่ได้สังเกตการเชื่อมโยงข้ามโปรตีนกับโปรตีนของโมเลกุล HLA-B/C กับโปรตีน H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าอันตรกิริยาของโปรตีนที่พบระหว่าง HLA-A, MDN1, LRCH1 และ HMGA1 นั้นมีความจำเพาะต่อ HLA-Aนอกจากนี้ การวิเคราะห์โปรตีโอมิกของตัวอย่างที่ไม่เชื่อมโยงข้าม (ตารางที่ S4) แสดงให้เห็นว่า HLA-A มีความครอบคลุมของลำดับที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ HLA-B หรือ HLA-Cเปปไทด์ที่ระบุสำหรับ HLA-A มีความเข้มข้นสูงทั้งในตัวอย่างที่ได้รับการรักษาด้วยIFNαและไม่ได้รับการรักษา
เพื่อให้แน่ใจว่าปฏิสัมพันธ์ที่ระบุในที่นี้ไม่ได้เกิดจากการเชื่อมโยงข้ามที่ไม่เฉพาะเจาะจงของโปรตีนสองตัวในบริเวณใกล้เคียงเชิงพื้นที่ เราได้ยืนยันเพิ่มเติมอีกสองปัจจัยที่มีปฏิสัมพันธ์ของ HLA-A ใหม่โดยทำการตรวจวิเคราะห์การตกตะกอนร่วมด้วยภูมิคุ้มกันบกพร่องตรวจพบปฏิสัมพันธ์ของ HLA-A กับ MDN1 และ H2B ภายนอกในเซลล์ Flo-1 ทั้งที่ได้รับIFNαและไม่ผ่านการบำบัด (รูปที่ 7, รูปที่ S4)เรายืนยันว่า HLA-A ถูกจับโดย H2B ในอิมมูโนพรีซิพิเตต และความสัมพันธ์นี้เกิดจากการรักษาIFNα เนื่องจาก HLA-A ขาดหายไปในตัวอย่างอิมมูโนพรีซิพิเตตจากเซลล์ที่ไม่ผ่านการบำบัด (รูปที่ 7A)อย่างไรก็ตาม ข้อมูลของเราแนะนำว่าIFNαควบคุมการจับ HLA-A กับ H2B และ MDN1 ที่แตกต่างกันIFNα ชักนำให้เกิดการเชื่อมโยงระหว่าง H2B และ HLA-A แต่ลดการเชื่อมโยงกับ MDN1เราพบว่า MDN1 มีความเกี่ยวข้องกับ HLA-A ในการควบคุม และการเพิ่มIFNαช่วยลดปฏิสัมพันธ์นี้โดยไม่ขึ้นกับการเหนี่ยวนำ MDN1 โดยIFNα (รูปที่ 7B,C)นอกจากนี้การตกตะกอนของภูมิคุ้มกันด้วย HLA-A จับ H2B ในเซลล์ A549 (รูปที่ S4) ซึ่งบ่งชี้ว่าปฏิกิริยานี้ไม่ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนอันตรกิริยาที่อาศัยอินเตอร์เฟอรอนเป็นสื่อกลางของ HLA-A กับ H2B และ MDN1
HLA-A ช่วยทำให้ H2B และ MDN1 บริสุทธิ์ร่วมกันอิมมูโนบล็อต H2B (A) และ MDN1 (B) ภายนอกที่เป็นตัวแทนได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันจากเซลล์ Flo-1 ที่ได้รับIFNαและตรวจสอบแอนติบอดีที่ระบุIgG ของหนูเมาส์และกระต่ายถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ(C) ปริมาณสัมพัทธ์ (อินพุต) ของแอนติเจนที่แตกต่างกันถูกแสดงโดยอิมมูโนบล็อตที่ตรวจสอบกับแอนติบอดีที่ระบุ β-actin ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด
มีการตรวจสอบคุณสมบัติเชิงโครงสร้างของหนึ่งในเครือข่ายเชื่อมโยงข้ามที่มีความน่าเชื่อถือสูงที่เกิดจากอินเตอร์เฟอรอน นั่นคือ H2B-HLA-A-HMGA1เราใช้การสร้างแบบจำลองพลศาสตร์ระดับโมเลกุลเป็นแนวทางทางเลือกเพื่อทำความเข้าใจพลวัตเชิงโครงสร้างของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับคอมเพล็กซ์นี้ (รูปที่ 8)การอนุมานจากข้อมูล CLMS เสนอแนะความเป็นไปได้ของความสอดคล้องที่แตกต่างกันของโปรตีน H2B, HLA-A และ HMGA1ดังนั้น สารเชิงซ้อนที่เป็นไปได้ต่อไปนี้ถูกจำลองในตัวกลางตัวทำละลาย: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A และ H2B-HLA-A-HMGA1หน้าจอเชื่อมต่อโปรตีน - โปรตีนเริ่มต้นโดยใช้แพ็คเกจ MOE (สภาพแวดล้อมการทำงานของโมเลกุล; Chemical Computing Group Inc., มอนทรีออล, ควิเบก, แคนาดา) แนะนำความสอดคล้องที่เป็นไปได้ที่แตกต่างกันระหว่างโปรตีนเหล่านี้ (รูปที่ 8A)การแสดงภาพคอมเพล็กซ์โปรตีนเชื่อมต่อเผยให้เห็นอันตรกิริยาหลายอย่างและโครงสร้างที่เป็นไปได้ (รูปที่ 5A, 8)ดังนั้น โครงสร้างที่เป็นไปได้อย่างหนึ่งถูกแสดงไว้ในรูปที่ 8A (ที่มีการเชื่อมโยงข้ามที่มีป้ายกำกับ) และมันถูกประเมินเพิ่มเติมโดยใช้ไปป์ไลน์การสร้างแบบจำลอง MDนอกจากนี้ การจับของ H2B หรือ HMGA1 กับ HLA-A เน้นย้ำถึงสัมพรรคภาพที่สูงขึ้นของ H2B สำหรับ HLA-A (รูปที่ 8A)
พลวัตเชิงโครงสร้างของเครือข่ายที่เป็นไปได้ระหว่างคอมเพล็กซ์ H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A และ H2B-HLA-A-HMGA1( A ) แผงด้านซ้ายเป็นแผนที่ 2 มิติ (สร้างในซอฟต์แวร์ SIM-XL) ของ crosslink ภายในโมเลกุล (สีแดง) และระหว่างโมเลกุล (สีน้ำเงิน) (ตั้งค่า crosslink cutoff เป็น 3.5)นอกจากนี้ เรซิดิวสำหรับการเชื่อมโยงข้ามที่ระบุถูกติดฉลากบนโครงสร้างของโปรตีน H2B, HLA-A และ HMGA1โครงสร้างที่เกี่ยวข้องของโปรตีนเหล่านี้ถูกสกัดโดยใช้ไปป์ไลน์การเชื่อมต่อที่ใช้ในแพ็คเกจ MOEแผงด้านซ้ายล่างแสดงการจัดรูปแบบที่เป็นไปได้ต่างๆ ของสารเชิงซ้อน H2B-HLA-A และ HMGA1-HLA-A ที่มีความชอบจับโปรตีน-โปรตีนที่แตกต่างกัน (GBVI/WSA dG; kcal/mol)(B) ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (RMSD) ของตำแหน่งอะตอม (ไม่รวมอะตอมไฮโดรเจน) สำหรับโครงสร้างโปรตีนแต่ละชนิด(C) ปฏิกิริยาระหว่างพันธะระหว่างโปรตีนและโปรตีนระหว่างโมเลกุลจากคอมเพล็กซ์จำลองต่างๆ โดยพิจารณาจากปฏิกิริยาเฉพาะของระยะเวลา ≥ 10 nsระยะตัดตัวรับผู้บริจาคพันธบัตร h ถูกตั้งค่าไว้ที่ 3.5 Å และมุมตัดของผู้บริจาค H-ผู้รับถูกตั้งไว้ที่ ≥ 160°–180°(D) สารตกค้างที่มีป้ายกำกับซึ่งก่อปฏิกิริยาระหว่างโปรตีน-โปรตีน HLA-A กับคู่ที่เกี่ยวข้อง ซึ่งครอบคลุม ≥ 20 ns ที่สกัดจากสารเชิงซ้อน HLA-A-H2B และ HLA-A-HMGA1 จำลองโครงสร้างโปรตีนแสดงโครงสร้างเฉลี่ย 100 ns MDS( E ) ปฏิสัมพันธ์ระหว่างคอมเพล็กซ์ HLA-A-H2B และ HLA-A-HMGA1 เมื่อเปรียบเทียบกับปฏิสัมพันธ์ที่ติดตามโดยการจำลอง H2B-HLA มากกว่า 100 ns ขึ้นอยู่กับไซต์ปฏิสัมพันธ์ K หรือ S ระหว่างเปปไทด์ทั้งสองสารเชิงซ้อน /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1ค่าเกณฑ์สำหรับการประเมินการเชื่อมโยงข้ามถูกตั้งไว้ที่ 3.0 และคำนึงถึงการโต้ตอบเฉพาะจาก MDS ที่คำนึงถึง ≥ 10 nsโครงสร้างโปรตีนถูกมองเห็นโดยใช้ BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) และสภาพแวดล้อมการทำงานระดับโมเลกุล (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada)
ความคงตัวของโมเลกุล HLA-A ตลอดเวลา (ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน; RMSD หรือส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน; RMSF) บ่งชี้ว่าการมีอยู่ของโปรตีน H2B หรือ HMGA1 ในสารเชิงซ้อนทำให้ HLA-A มีความเสถียร (รูปที่ 8B, รูปที่ S5)โปรตีน HMGA1 จับกันอย่างแน่นหนากับตำแหน่ง B2M ของ HLA-A ซึ่งกระตุ้นความเสถียรของกรดอะมิโน HLA-A ในสารเชิงซ้อน HLA-A-HMGA1 หรือ H2B-HLA-A-HMGA1 (รูปที่ 8B, รูปที่ S5)โดยเฉพาะอย่างยิ่ง HLA เรซิดิว ~60-90 และ ~180-210 ถูกพบว่ามีความยืดหยุ่นน้อยกว่าเมื่อมี H2B (รูปที่ 8B)H2B และ HMGA1 แสดงการจับที่ดีกว่ากับ HLA-A ในสารเชิงซ้อน H2B-HLA-A-HMGA1 เมื่อเปรียบเทียบกับการจับ HLA-A กับ H2B หรือ HMGA1 เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 8C,D; ตาราง S5)สารตกค้างที่เกี่ยวข้องกับพันธะไฮโดรเจน (MD จำลองอัตราการครอบครองสูง ≥ 10 ns) ตรงกับไซต์ปฏิสัมพันธ์ของ CLMS (สารตกค้าง K หรือ S) ในคอมเพล็กซ์ ซึ่งบ่งบอกว่าปฏิกิริยาที่ระบุโดย CLMS มีความน่าเชื่อถือมากความน่าเชื่อถือ (รูปที่ 8E ).ในการสร้างแบบจำลอง CLMS และ MD, HLA-A เรซิดิวระหว่างกรดอะมิโนประมาณ 190-210 และประมาณ 200-220 ถูกพบว่าจับ H2B และ HMGA1 ตามลำดับ (รูปที่ 8E)
ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีนก่อให้เกิดเครือข่ายโครงสร้างแบบไดนามิกที่เป็นสื่อกลางในการสื่อสารภายในเซลล์เพื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้าบางอย่างเนื่องจากแนวทางโปรตีโอมิกส์หลายวิธีตรวจจับการเปลี่ยนแปลงในระดับสถานะคงตัวโดยรวมของโปรตีน พลวัตของปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีนจึงจำเป็นต้องมีเครื่องมือเพิ่มเติมเพื่อจับส่วนต่อประสานการจับ และ CLMS ก็เป็นหนึ่งในเครื่องมือดังกล่าวระบบส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอนเป็นเครือข่ายไซโตไคน์ที่ช่วยให้เซลล์ตอบสนองต่อสัญญาณทางพยาธิวิทยาที่ทำให้เกิดโรคในสิ่งแวดล้อมและทางพยาธิวิทยาจากภายใน ซึ่งไปสิ้นสุดที่การเหนี่ยวนำชุดย่อยของโปรตีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดอินเตอร์เฟอรอนได้เราใช้ CLMS เพื่อตรวจสอบว่าสามารถระบุปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีนแบบใหม่ในแผงโปรตีนที่เกิดจากอินเตอร์เฟอรอนได้หรือไม่การวิเคราะห์การเชื่อมโยงข้ามโปรตีนแบบโกลบอลในแบบจำลองเซลล์ Flo-1 ที่ตอบสนองต่ออินเตอร์เฟอรอนถูกนำมาใช้เพื่อจับโปรตีนเชิงซ้อนการสกัดเปปไทด์ทริปติกจากเซลล์ที่ไม่เชื่อมโยงข้ามและเซลล์เชื่อมโยงข้ามช่วยให้สามารถนับเปปไทด์ การเพิ่มคุณค่าของวิถีทาง และการกระจายความยาวเปปไทด์ด้วยความเข้มของ LFQ ที่กำหนดไว้โปรตีนที่เหนี่ยวนำด้วยอินเตอร์เฟอรอนแบบคาโนนิคัลถูกระบุว่าเป็นการควบคุมภายในเชิงบวก ในขณะที่ adducts ที่เชื่อมโยงระหว่างโมเลกุลและภายในโมเลกุลแบบใหม่ของโปรตีนที่เหนี่ยวนำด้วยอินเตอร์เฟอรอนแบบคาโนนิคัล เช่น MX1, UP18, OAS3 และ STAT1 ถูกสังเกตมีการตรวจสอบคุณสมบัติโครงสร้างและการโต้ตอบต่าง ๆ ในพื้นที่การทำงาน
ตรวจพบปฏิสัมพันธ์ระหว่าง HLA-A, MDN1 และ H2B โดย immunoblotting ในเซลล์ Flo-1 และ A549 ที่รักษาและไม่ได้รับการรักษาด้วยIFNαผลลัพธ์ของเราเน้นว่าคอมเพล็กซ์ HLA-A กับ H2B ในลักษณะที่ขึ้นกับIFNαงานของเราเป็นช่องทางที่น่าสนใจสำหรับการสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับการแปลร่วมของคอมเพล็กซ์ทั้งสองนี้นอกจากนี้ยังเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะขยายแนวทาง CLMS ไปยังแผงเซลล์เพื่อระบุปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนที่ใช้สื่อกลางระหว่างอินเตอร์เฟอรอนที่เป็นอิสระจากเซลล์ในที่สุด เราใช้การสร้างแบบจำลอง MD เป็นแนวทางทางเลือกในการทำความเข้าใจพลวัตเชิงโครงสร้างของโปรตีนที่เกี่ยวข้องในคอมเพล็กซ์ H2BFS-HLA-A-HMGA1 ซึ่งติดตามการพูดคุยข้ามโมเลกุลและระหว่างโมเลกุลการอนุมานจากข้อมูล CLMS เสนอแนะความเป็นไปได้ของความสอดคล้องที่แตกต่างกันของโปรตีน H2BFS, HLA-A และ HMGA1ความสอดคล้องที่แตกต่างกันที่เป็นไปได้ระหว่างคอมเพล็กซ์โปรตีนเชื่อมต่อเหล่านี้เผยให้เห็นปฏิกิริยาหลายอย่างที่คล้ายคลึงกับที่พบในชุดข้อมูล CLMSจุดแข็งหลักประการหนึ่งของวิธีการของเราคือ ช่วยให้ระบุยีนที่มีปฏิกิริยาหลายรูปแบบสูงอย่าง HLA ที่มีปฏิสัมพันธ์ได้ง่าย ดังนั้นจึงเป็นเรื่องน่าสนใจที่จะศึกษาปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนที่จำเพาะต่อแฮโพไทป์ HLA ซึ่งหากไม่เช่นนั้นจะศึกษาได้ยากเมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่า CLMS สามารถใช้เพื่อขยายความเข้าใจของเราเกี่ยวกับเครือข่ายการส่งสัญญาณที่เกิดจากอินเตอร์เฟอรอน และเป็นพื้นฐานสำหรับการศึกษาระบบระหว่างเซลล์ที่ซับซ้อนมากขึ้นในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก
ได้รับเซลล์ Flo-1 จาก ATCC และบำรุงรักษาใน DMEM (Gibco) เสริมด้วย 1% เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน (Invitrogen), 10% ซีรั่มของวัวของทารกในครรภ์ (Gibco) และเก็บไว้ที่ 37°C และ 5% CO2การฟักตัวเซลล์ถูกทำให้เจริญจนถึงจุดบรรจบกัน 70-80% ก่อนที่จะถูกบำบัดด้วยIFNα14 (ผลิตโดยโรงงานผลิตโปรตีนเอดินบะระ)สารเคมีและรีเอเจนต์อื่นๆ ทั้งหมดซื้อจาก Sigma Aldrich เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น
เซลล์ Flo-1 ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 6 หลุมและในวันถัดไป เซลล์ถูกบำบัดด้วย 10 นาโนกรัม/มิลลิลิตร IFNα14 เป็นเวลา 24 ชั่วโมงจนถึงจุดบรรจบกันประมาณ 80%เซลล์ถูกล้างสามครั้งด้วย PBS และมัดด้วย DSS (เทอร์โม ฟิชเชอร์ ไซแอนทิฟิค) ที่เตรียมสดใหม่ (ละลายใน DMSO) ใน PBS เป็นเวลา 5 นาทีที่ 37° C จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 0.5 มิลลิโมลาร์ปฏิกิริยาการเชื่อมโยงข้าม DSS ถูกแทนที่ด้วย PBS และ DSS ตกค้างถูกระงับโดยการเติมทริส 20 มิลลิโมลาร์ (pH 8.0) ใน PBS เป็นเวลา 15 นาทีที่ 37°Cเซลล์ถูกเก็บรวบรวมโดยการขูดและเก็บรวบรวมในหลอดที่มีการจับต่ำ (Axygen)
เซลล์เพลเลตถูกสลายด้วยยูเรียลิซิสบัฟเฟอร์ 300 ไมโครลิตร (8 โมลาร์ยูเรีย, 0.1 โมลาร์ทริส, pH 8.5) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องโดยมีการเขย่าเป็นครั้งคราวขั้นตอนการปั่นแยกทั้งหมดถูกดำเนินการที่ 14,000 xg ที่ 8°Cปั่นแยกไลเซตเป็นเวลา 10 นาทีแล้วย้ายส่วนเหนือตะกอนไปยังหลอดใหม่อนุภาคใสที่เหลือถูกละลายใน 150 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์สลายตัวที่สอง (2 โมลาร์ยูเรีย, 2% (w/v) SDS (โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต)) เป็นเวลา 30 นาทีหรือมากกว่านั้นจนกระทั่งได้รับสารละลายในน้ำที่เป็นเนื้อเดียวกันไลเซตถูกปั่นแยกเป็นเวลา 20 นาที และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกผสมกับไลเซตที่ได้รับในขั้นตอนก่อนหน้าประเมินความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้การทดสอบ Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับขั้นตอนไมโครเพลทตัวอย่างถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ -80°C
ประมาณ 100 ไมโครกรัมของโปรตีนเชื่อมโยงข้ามที่ละลายได้ถูกประมวลผลโดยใช้โปรโตคอลการเตรียมตัวอย่างการกรองแบบดัดแปลง (FASP) ตามที่อธิบายโดย Wisniewski และคณะ69 โดยสรุป โปรตีนถูกเชื่อมขวางกับยูเรียบัฟเฟอร์ 200 ไมโครลิตร (8 โมลาร์ยูเรียใน 0.1 โมลาร์ทริส, pH 8.5), หมุนวนและลดลงครึ่งหนึ่งขั้นตอนการปั่นแยกทั้งหมดถูกดำเนินการที่ 14,000 xg ที่ 25°Cครึ่งแรกของโปรตีนไลเซตที่ถูกเชื่อมโยงข้ามถูกถ่ายโอนไปยังอุปกรณ์กรองแบบหมุนเหวี่ยง Microcon ขนาด 10 kDa ที่ติดตั้งเมมเบรน Ultracel-10 (เมอร์ค) ตามด้วยการปั่นแยกบนตัวกรองเป็นเวลา 25 นาทีจากนั้นเติมโปรตีนครึ่งหลังลงในตัวกรองแล้วทำซ้ำขั้นตอนเดียวกันการนำโปรตีนกลับคืนทำได้โดยการเติมทริส(2-คาร์บอกซีเอทิล)ฟอสฟีน ไฮโดรคลอไรด์ (TCEP) 100 ไมโครลิตร 17 มิลลิโมลาร์ในบัฟเฟอร์ยูเรียการนำกลับคืนถูกกวนบนเทอร์โมมิกเซอร์ที่ 600 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37°Cนอกจากนี้ คอลัมน์ถูกหมุนเหวี่ยงและโปรตีนเชื่อมโยงข้ามที่รีดิวซ์ถูกทำให้เป็นอัลคิลเลตโดยใช้ไอโอโดอะซีทาไมด์ 50 มิลลิโมลาร์ 100 ไมโครลิตรในบัฟเฟอร์ยูเรียปฏิกิริยาอัลคิเลชันถูกดำเนินการที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาทีในความมืดหมุนคอลัมน์ ล้างผนังคอลัมน์ 3 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์ยูเรีย 100 ไมโครลิตร จากนั้นหมุนเหวี่ยงการดำเนินการเดียวกันถูกดำเนินการ 3 ครั้งโดยใช้แอมโมเนียม ไบคาร์บอเนต 100 ไมโครลิตร 100 มิลลิโมลาร์ก่อนทำการทริปซิไนซ์ ให้เปลี่ยนท่อรวบรวมด้วยหลอดใหม่เพิ่มบัฟเฟอร์การย่อยที่มีแอมโมเนียม ไบคาร์บอเนต 50 มิลลิโมลาร์ และทริปซิน 1 ไมโครลิตรที่เจือจางในบัฟเฟอร์ทริปซิน (โพรเมกา)อัตราส่วนของทริปซินต่อโปรตีนถูกคงไว้ที่ประมาณ 1:33 และปฏิกิริยาการย่อยถูกบ่มข้ามคืนที่ 37° C ในห้องชื้นเพปไทด์ที่ถูกเชื่อมโยงข้ามถูกชะออกจากตัวกรองโดยการหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 25 นาทีการนำเปปไทด์กลับคืนได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นโดยการเติม NaCl 0.5 โมลาร์ 50 ไมโครลิตรไปยังตัวกรอง ตามด้วยการปั่นแยกเป็นเวลา 25 นาที
คอลัมน์ C18 Micro Spin (เครื่องมือของฮาร์วาร์ด) ถูกนำมาใช้เพื่อแยกเกลือเปปไทด์ทริปติกที่เชื่อมโยงข้ามตามโปรโตคอลที่อธิบายโดย Bouchal และคณะ พร้อมการแก้ไขเล็กน้อยโดยสรุป คอลัมน์สปิน C18 ถูกกระตุ้นด้วยการล้างสามครั้งของกรดฟอร์มิก (FA) 0.1% ในอะซีโตไนไตรล์ (AcN) (เมอร์ค) และการล้างสองครั้งที่ 0.1% FAคอลัมน์ถูกไฮเดรตด้วย 0.1% FA เป็นเวลา 15 นาทีใส่ตัวอย่างลงในคอลัมน์หมุนแล้วล้าง 3 ครั้งด้วย FA 0.1%เพปไทด์ที่ถูกแยกเกลือออกถูกชะตามลำดับด้วยเกรเดียนต์แบบขั้นตอนโดยใช้ 50%, 80% และ 100% AcN ใน 0.1% FAตัวอย่างถูกทำให้แห้งในเครื่องสร้างความเข้มข้น SpeedVac Plus (Eppendorf) จนกระทั่งของเหลวที่ตกค้างหายไปจนหมดเปปไทด์ที่ถูกชะถูกละลายใน 100 ไมโครลิตรของกรดไตรฟลูออโรอะซิติก 0.08% ใน AcN 2.5% และวัดความเข้มข้นบน NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)เพปไทด์เชื่อมโยงข้ามประมาณ 1 ไมโครกรัมต่อตัวอย่างถูกฉีดเข้าไปในระบบ LC-MS/MS
เพปไทด์เชื่อมโยงข้ามถูกแยกบนระบบ UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) ที่เชื่อมต่อกับแมสสเปกโตรมิเตอร์ Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific)เปปไทด์ที่ถูกเชื่อมโยงข้ามถูกรวบรวมบน ID 300 ไมโครเมตร, คอลัมน์การจับ C18 ล่วงหน้าคอลัมน์ยาว 5 มม. ที่อัดแน่นด้วยตัวดูดซับ C18 PepMap100 และตัวดูดซับ PepMap 5 ไมโครเมตร (Thermo Scientific)โหลดการไหลของปั๊มที่ตั้งไว้ที่ 5 ไมโครลิตร/นาที กรดไตรฟลูออโรอะซิติก 0.08% ละลายใน 2.5% AcNเปปไทด์เชื่อมโยงข้ามถูกแยกออกจากคอลัมน์ซิลิกาหลอมรวมเชิงวิเคราะห์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 75 ไมโครเมตร และความยาว 150 มม. เติมด้วยตัวดูดซับ PepMap 2 ไมโครเมตร (Thermo Scientific)เฟสเคลื่อนที่ A และ B ประกอบด้วย FA 0.1% ในน้ำและ 0.1% FA ในอะซีโตไนไตรล์ ตามลำดับการไล่ระดับสีเริ่มต้นที่ 2.5% B และเพิ่มขึ้นเชิงเส้นเป็น 40% B ตลอด 90 นาที จากนั้นเป็น 90% B ในอีก 2 นาทีข้างหน้าองค์ประกอบเฟสเคลื่อนที่ถูกคงรักษาไว้ที่ 90% B เป็นเวลา 10 นาทีและจากนั้นลดลงในเชิงเส้นตรงจนถึง 2.5% B ตลอด 2 นาทีคอลัมน์ถูกปรับสมดุลที่ 2.5% B เป็นเวลา 8 นาทีก่อนรอบถัดไปเปปไทด์แบบเชื่อมโยงข้ามที่ชะออกมาจากคอลัมน์การวิเคราะห์จะถูกแตกตัวเป็นไอออนในแหล่งนาโนอิเล็กโทรสเปรย์ไอออไนเซชัน (NSI) และฉีดเข้าไปในแมสสเปกโตรมิเตอร์ Exploris 480 (Thermo Scientific)
แมสสเปกโตรมิเตอร์ Orbitrap Exploris 480 ทำงานในโหมดความสัมพันธ์ของข้อมูลเชิงบวกทำการสแกนแบบเต็มในโหมดส่วนที่ความละเอียด 120,000 ด้วยการตั้งค่าช่วงตั้งแต่ m/z 350 Th ถึง m/z 2000 Thเป้าหมาย AGC ที่ทำให้เป็นมาตรฐานตั้งไว้ที่ 300% โดยมีเวลาอินพุตสูงสุด 50 มิลลิวินาทีมีการกำหนดการตรวจจับจุดสูงสุดแบบโมโนไอโซโทปสำหรับเปปไทด์พารามิเตอร์การผ่อนคลายข้อจำกัดถูกตั้งค่าเป็นจริงหากพบสารตั้งต้นน้อยเกินไปความแรงไอออนิกขั้นต่ำของสารตั้งต้นถูกตั้งค่าไว้ที่ 5.0e3 และสถานะประจุของสารตั้งต้นสูงถึง +8 ถูกรวมไว้ในการทดลองด้วย
รอบเวลาระหว่างการสแกนหลักในโหมดความสัมพันธ์ของข้อมูลถูกตั้งไว้ที่ 2.5 วินาทีการแยกมวลแบบไดนามิกถูกตั้งค่าเป็น 20 วินาทีหลังจากการแตกตัวครั้งแรกของไอออนของสารตั้งต้นหน้าต่างการแยกสารตั้งต้นถูกตั้งค่าเป็น 2 Thประเภทของพลังงานการชนกันแบบปกติที่มีโหมดพลังงานการชนแบบคงที่ถูกเลือกในการสแกน MS/MS ที่ขึ้นกับข้อมูลพลังงานการชนตั้งไว้ที่ 30%ความละเอียดของ Orbitrap ถูกกำหนดไว้ที่ 15,000 และเป้าหมาย AGC อยู่ที่ 100%เวลาฉีดสูงสุดที่กำหนดเองตั้งไว้ที่ 60 มิลลิวินาที
ก่อนที่จะติดตามเครือข่ายโปรตีน-โปรตีนในตัวอย่างที่เชื่อมโยงข้าม เราได้ประมวลผลไฟล์ดิบโดยใช้แพ็คเกจ MaxQuant (เวอร์ชัน 1.6.12.0)26,27 เพื่อระบุเปปไทด์/โปรตีนที่ตรวจสอบย้อนกลับได้ในตัวอย่างนอกจากนี้ การวิเคราะห์โปรตีโอมิกที่คล้ายกันถูกดำเนินการกับตัวอย่าง Flo-1 ที่ไม่เชื่อมโยงข้ามที่บำบัดและไม่ถูกบำบัดด้วย IFNαค้นหาข้อมูล MS/MS ในฐานข้อมูลมนุษย์ของ UniProt (www.uniprot.org) (อัปโหลดเมื่อวันที่ 12 สิงหาคม 2020 มี 75,093 รายการ) โดยใช้เครื่องมือค้นหา Andromeda27 ในตัวการค้นหาดำเนินการโดยไม่ระบุความจำเพาะของเอนไซม์และการดัดแปลงต่างๆ ของดีอะมิเดชัน (N, Q) และออกซิเดชัน (M)ความคลาดเคลื่อนของมวลสารตั้งต้นถูกกำหนดไว้ที่ 20 ppm และไอออนผลิตภัณฑ์ที่ 0.02 Daค่าเบี่ยงเบนมวลเริ่มต้นและสูงสุดถูกกำหนดไว้ที่ 10 ppmมวลสูงสุดของเปปไทด์ถูกกำหนดไว้ที่ 4600 Da และความคล้ายคลึงกันของลำดับถูกตั้งค่าระหว่างกรดอะมิโน 7 ถึง 25 ตัว (aa)การวิเคราะห์ทางสถิติเพิ่มเติมดำเนินการโดยใช้โปรแกรม Perseus (เวอร์ชัน 1.6.10.45)ปริมาณโปรตีนคำนวณโดยการทำให้ความเข้มสเปกตรัมของโปรตีนเป็นปกติ (ความเข้มของ LFQ; ปริมาณที่ไม่มีป้ายกำกับ) และค่าความเข้มถูกแปลงเป็น Log2การจัดกลุ่มโปรตีนแบบลำดับชั้นที่ระบุโดยความเข้มของเปปไทด์ถูกสร้างขึ้นโดยใช้แพ็คเกจ pheatmap (v1.0.12) ใน R (v 4.1.2)การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของวิถีทางถูกดำเนินการโดยใช้ฐานข้อมูลวิถีของรีแอคโตมสำหรับโปรตีนที่บำบัดด้วย IFNα ที่ถูกกระตุ้นมากกว่าสี่เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างที่ไม่บำบัด
การระบุการเชื่อมโยงข้ามทางเคมีเฉพาะของไลซีน (K) หรือซีรีน (S) ของโปรตีนเชิงซ้อนที่ตรวจสอบโดย LC-MS/MS ดำเนินการโดยใช้เครื่องระบุสเปกโทรสโกปี (SIM-XL) สำหรับเปปไทด์ที่เชื่อมโยงข้าม (SIM-XL)ประการแรก ปฏิสัมพันธ์ที่เป็นไปได้ระหว่างยีนต้านทานความเสียหายของดีเอ็นเอที่เกี่ยวข้องกับอินเตอร์เฟอรอน (IFN) (IRDS) ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ชุดข้อมูลโปรตีน IRDS ที่อธิบายไว้ใน Padariya และคณะ 28การคัดกรองเงื่อนไขและการทำซ้ำทั้งหมดของ UniProt ของมนุษย์นั้นมีความเข้มข้นในการคำนวณ ดังนั้นฐานข้อมูล UniProt ของมนุษย์ทั้งหมด (www.uniprot.org) (ดาวน์โหลดเมื่อวันที่ 12 สิงหาคม 2020 มี 75,093 รายการ) เทียบกับการทำซ้ำที่ได้รับ IFNαหนึ่งในตัวกรองสำหรับการโต้ตอบที่มีความน่าเชื่อถือสูงการโต้ตอบที่มีนัยสำคัญสูงเหล่านี้ได้รับการขยายและทดสอบในการทำซ้ำและเงื่อนไขทั้งหมด
ใน SIM-XL นั้น DSS ถูกใช้สำหรับตัวเชื่อมโยงข้าม (XL) และการเปลี่ยนน้ำหนัก XL และการปรับเปลี่ยนน้ำหนักถูกตั้งค่าเป็น 138.06 และ 156.07 ตามลำดับพิจารณาตำแหน่งปฏิกิริยาเชื่อมขวางต่อไปนี้: KK, KS และ KN-TERM โดยไม่มีไอออนรีพอร์ตเตอร์ทั้งสารตั้งต้นและแฟรกเมนต์ ppm ถูกตั้งค่าเป็น 20 และขีดจำกัด Xrea ถูกตั้งค่าเป็น 0.15ทริปซินได้รับการพิจารณาว่ามีความจำเพาะเจาะจงอย่างสมบูรณ์ และใช้วิธีการแยกส่วน C-trap (HCD) พลังงานสูงเกณฑ์การลดฐานข้อมูลแบบไดนามิกของ XCorr และจำนวนเปปไทด์ขั้นต่ำสำหรับการลดฐานข้อมูลแบบไดนามิกถูกตั้งค่าไว้ที่ 2.5 และ 2 ตามลำดับพารามิเตอร์อื่นๆ ได้แก่ ความน่าจะเป็นแบบโมโนไอโซโทปและจุดตัดความบังเอิญสูงสุด ปริมาณ AA ตกค้างขั้นต่ำ 4 AA ต่อเกลียวและประจุสูงสุดของเกลียว และค่าสูงสุด 3 ของการแยกที่พลาดแผนที่ 2D ที่ต่อกันเป็นผลลัพธ์ได้รับการวิเคราะห์ใน (SIM-XL) และใช้การแสดงกราฟิก xQuest28 เพื่อสร้างแผนที่ 2Dการเชื่อมขวางของโปรตีนบนโครงสร้างโปรตีนมีอยู่ใน PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, เวอร์ชัน 2.0 Schrödinger, LLC)
โครงสร้างแบบจำลองโปรตีนถูกสร้างขึ้นโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) โดยใช้หลักการของการสร้างแบบจำลองคล้ายคลึงกันและการนำ "วิธีซ่อนมาร์คอฟ" ไปใช้Phyre2 สร้างโครงสร้างแบบจำลองตามลำดับการจัดตำแหน่งกับโครงสร้างโปรตีนที่รู้จักสำหรับโปรตีน H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 และ MDN1 โครงสร้างเทมเพลต 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 และ 6i2665 ถูกนำมาใช้นอกจากนี้ ยังพิจารณาโครงสร้างของ AlphaFold71 MX1, UBP18 และ ROBO1 อีกด้วยโครงสร้างโปรตีนถูกมองเห็นโดยใช้แพ็คเกจ BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) และแพ็คเกจสภาพแวดล้อมการทำงานระดับโมเลกุล (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada)