ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comคุณกำลังใช้เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่มีการรองรับ CSS แบบจำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
แถบเลื่อนแสดงสามบทความต่อสไลด์ใช้ปุ่มย้อนกลับและปุ่มถัดไปเพื่อเลื่อนไปตามสไลด์ หรือใช้ปุ่มตัวควบคุมสไลด์ที่ส่วนท้ายเพื่อเลื่อนไปตามแต่ละสไลด์

317 ผู้จำหน่ายท่อขดสแตนเลส

ตารางองค์ประกอบทางเคมีของวัสดุสแตนเลส

SPACA6 เป็นโปรตีนบนพื้นผิวที่แสดงตัวอสุจิซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการหลอมรวมของเซลล์สืบพันธุ์ในระหว่างการสืบพันธุ์แบบอาศัยเพศของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมแม้จะมีบทบาทพื้นฐานนี้ แต่ฟังก์ชันเฉพาะของ SPACA6 ยังไม่ค่อยเข้าใจเราอธิบายโครงสร้างผลึกของโดเมนนอกเซลล์ของ SPACA6 ที่ความละเอียด 2.2 Å เผยให้เห็นโปรตีนสองโดเมนที่ประกอบด้วยมัดสี่เกลียวและแซนด์วิชβ-like Ig ที่เชื่อมต่อกันด้วยตัวเชื่อมโยงกึ่งยืดหยุ่นโครงสร้างนี้มีลักษณะคล้ายกับ IZUMO1 ซึ่งเป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับฟิวชันของเซลล์สืบพันธุ์อีกชนิดหนึ่ง ทำให้ SPACA6 และ IZUMO1 ก่อตั้งสมาชิกในกลุ่มซูเปอร์แฟมิลีของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการปฏิสนธิ ซึ่งเรียกในที่นี้ว่าซูเปอร์แฟมิลี ISTซูเปอร์แฟมิลี IST ถูกกำหนดเชิงโครงสร้างโดยมัดสี่เกลียวที่บิดเบี้ยวและโมทีฟ CXXC ที่เชื่อมโยงกับไดซัลไฟด์คู่หนึ่งการค้นหาโปรตีโอมของมนุษย์ตามโครงสร้างของ AlphaFold ระบุสมาชิกโปรตีนเพิ่มเติมของซูเปอร์แฟมิลีนี้โดยเฉพาะอย่างยิ่งโปรตีนเหล่านี้จำนวนมากเกี่ยวข้องกับการหลอมรวมของเซลล์สืบพันธุ์โครงสร้าง SPACA6 และความสัมพันธ์กับสมาชิกคนอื่นๆ ของ IST superfamily ทำให้เกิดการเชื่อมโยงที่ขาดหายไปในความรู้ของเราเกี่ยวกับการหลอมรวมเซลล์สืบพันธุ์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม
ชีวิตมนุษย์ทุกคนเริ่มต้นด้วยเซลล์สืบพันธุ์เดี่ยวสองตัวที่แยกจากกัน ได้แก่ อสุจิของพ่อและไข่ของแม่อสุจินี้เป็นผู้ชนะในกระบวนการคัดเลือกอย่างเข้มข้น โดยในระหว่างที่เซลล์อสุจิหลายล้านเซลล์ผ่านบริเวณอวัยวะเพศหญิง เอาชนะอุปสรรคต่างๆ1 และผ่านกระบวนการคัดเลือก ซึ่งช่วยเพิ่มความสามารถในการเคลื่อนไหวและกระบวนการของส่วนประกอบบนพื้นผิว2,3,4แม้ว่าอสุจิและโอโอไซต์จะพบกัน แต่กระบวนการยังไม่สิ้นสุดโอโอไซต์ล้อมรอบด้วยชั้นของเซลล์คิวมูลัสและตัวกั้นไกลโคโปรตีนที่เรียกว่าโซนา เพลลูซิดา ซึ่งสเปิร์มจะต้องผ่านเข้าสู่โอโอไซต์ตัวอสุจิใช้การผสมผสานระหว่างโมเลกุลการยึดเกาะบนพื้นผิวและเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับเมมเบรนและหลั่งออกมาเพื่อเอาชนะอุปสรรคสุดท้ายเหล่านี้โมเลกุลและเอนไซม์เหล่านี้ส่วนใหญ่ถูกเก็บไว้ในเยื่อหุ้มชั้นในและเมทริกซ์อะโครโซม และตรวจพบเมื่อเยื่อหุ้มชั้นนอกของสเปิร์มถูกสลายในระหว่างปฏิกิริยาอะโครโซม6ขั้นตอนสุดท้ายในการเดินทางอันเข้มข้นนี้คือเหตุการณ์ฟิวชั่นของอสุจิและไข่ ซึ่งเซลล์ทั้งสองจะหลอมรวมเยื่อหุ้มของพวกมันให้กลายเป็นสิ่งมีชีวิตแบบดิพลอยด์เดี่ยว7แม้ว่ากระบวนการนี้จะก้าวล้ำในการสืบพันธุ์ของมนุษย์ แต่ปฏิสัมพันธ์ของโมเลกุลที่จำเป็นยังไม่เป็นที่เข้าใจ
นอกเหนือจากการปฏิสนธิของเซลล์สืบพันธุ์แล้ว ยังมีการศึกษาทางเคมีของการหลอมรวมของชั้นไขมันสองชั้นอีกด้วยโดยทั่วไป ฟิวชันเมมเบรนเป็นกระบวนการที่ไม่เอื้ออำนวยอย่างมาก ซึ่งต้องใช้ตัวเร่งปฏิกิริยาโปรตีนเพื่อรับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโครงสร้างที่ทำให้เมมเบรนทั้งสองอยู่ใกล้กันมากขึ้น ทำลายความต่อเนื่องของพวกมันและทำให้เกิดการหลอมรวม8,9ตัวเร่งปฏิกิริยาโปรตีนเหล่านี้เรียกว่าฟิวโซเจนและพบได้ในระบบฟิวชันจำนวนนับไม่ถ้วนจำเป็นสำหรับการที่ไวรัสเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน (เช่น gp160 ใน HIV-1, โคโรนาไวรัสที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว, เฮมักกลูตินินในไวรัสไข้หวัดใหญ่) 10,11,12 รก (ซินซิติน) 13,14,15 และการสร้างเซลล์สืบพันธุ์ในยูคาริโอตตอนล่าง ( HAP2/GCS1 ในพืช กลุ่มผู้ประท้วง และสัตว์ขาปล้อง) 16,17,18,19ยังไม่มีการค้นพบฟิวโซเจนสำหรับเซลล์สืบพันธุ์ของมนุษย์ แม้ว่าโปรตีนหลายชนิดจะแสดงให้เห็นว่ามีความสำคัญต่อการเกาะติดของเซลล์สืบพันธุ์และการหลอมรวมก็ตามCD9 ที่แสดงโอโอไซต์ซึ่งเป็นโปรตีนเมมเบรนที่จำเป็นสำหรับการหลอมรวมของหนูและเซลล์สืบพันธุ์ของมนุษย์ เป็นกลุ่มแรกที่ถูกค้นพบ 21,22,23แม้ว่าการทำงานที่แม่นยำของมันยังไม่ชัดเจน แต่บทบาทในการยึดเกาะ โครงสร้างของจุดโฟกัสของการยึดเกาะบนไมโครวิลลี่ไข่ และ/หรือตำแหน่งที่ถูกต้องของโปรตีนบนพื้นผิวโอโอไซต์ดูเหมือนจะอยู่ที่ 24,25,26โปรตีนทั่วไปสองชนิดที่มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการหลอมรวมของเซลล์สืบพันธุ์คือโปรตีนสเปิร์ม IZUMO127 และโปรตีนโอโอไซต์ JUNO28 และการเชื่อมโยงร่วมกันของพวกมันเป็นขั้นตอนสำคัญในการรับรู้และการยึดเกาะของเซลล์สืบพันธุ์ก่อนการหลอมรวมหนูน็อกเอาต์ Izumo1 ตัวผู้และหนูน็อกเอาต์จูโนตัวเมียนั้นผ่านการฆ่าเชื้ออย่างสมบูรณ์ ในโมเดลเหล่านี้ สเปิร์มจะเข้าสู่ช่องว่างเพอริวิเทลลีน แต่เซลล์สืบพันธุ์จะไม่หลอมรวมกันในทำนองเดียวกัน การบรรจบกันลดลงเมื่อเซลล์สืบพันธุ์ได้รับการบำบัดด้วยแอนติบอดีต้าน IZUMO1 หรือ JUNO27,29 ในการทดลองการปฏิสนธินอกร่างกายของมนุษย์
เมื่อเร็วๆ นี้ มีการค้นพบกลุ่มของโปรตีนที่แสดงสเปิร์มซึ่งมีลักษณะทางฟีโนไทป์คล้ายกับ IZUMO1 และ JUNO20,30,31,32,33,34,35 ที่ค้นพบใหม่โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเยื่อหุ้มอสุจิอะโครโซม 6 (SPACA6) ได้รับการระบุว่าจำเป็นสำหรับการปฏิสนธิในการศึกษาการกลายพันธุ์ของหนูในวงกว้างการแทรกยีนเข้าไปในยีน Spaca6 จะสร้างตัวอสุจิที่ไม่สามารถหลอมละลายได้ แม้ว่าตัวอสุจิเหล่านี้จะแทรกซึมเข้าไปในช่องว่างของเพอริวิเทลลีนก็ตาม 36การศึกษาที่น่าพิศวงครั้งต่อมาในหนูยืนยันว่าจำเป็นต้องใช้ Spaca6 สำหรับ gamete fusion 30,32SPACA6 แสดงออกเกือบเฉพาะในอัณฑะและมีรูปแบบการแปลเฉพาะที่คล้ายกับ IZUMO1 กล่าวคือ ภายในชั้นเชิงของตัวอสุจิก่อนเกิดปฏิกิริยาอะโครโซม และจากนั้นจึงย้ายไปยังบริเวณเส้นศูนย์สูตรหลังจากปฏิกิริยาอะโครโซม 30,32ความคล้ายคลึงกันของ Spaca6 มีอยู่ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหลายชนิดและยูคาริโอต 30 อื่นๆ และความสำคัญของมันสำหรับการหลอมรวมเซลล์สืบพันธุ์ของมนุษย์นั้นแสดงให้เห็นโดยการยับยั้งการปฏิสนธิของมนุษย์ ในหลอดทดลอง โดยการต้านทานต่อ SPACA6 30รายละเอียดของโครงสร้าง การโต้ตอบ และการทำงานของ SPACA6 ต่างจาก IZUMO1 และ JUNO ยังไม่ชัดเจน
เพื่อให้เข้าใจกระบวนการพื้นฐานที่เป็นรากฐานของการหลอมรวมของอสุจิและไข่ของมนุษย์ได้ดีขึ้น ซึ่งจะช่วยให้เราทราบถึงการพัฒนาในอนาคตในการวางแผนครอบครัวและการรักษาภาวะเจริญพันธุ์ เราได้ดำเนินการศึกษาโครงสร้างและชีวเคมีของ SPACA6โครงสร้างผลึกของโดเมนนอกเซลล์ของ SPACA6 แสดงมัดสี่ขดลวด (4HB) และโดเมนคล้ายอิมมูโนโกลบูลิน (คล้าย Ig) เชื่อมต่อกันด้วยบริเวณกึ่งยืดหยุ่นตามที่คาดการณ์ไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ 7, 32, 37 โครงสร้างโดเมนของ SPACA6 นั้นคล้ายคลึงกับ IZUMO1 ของมนุษย์ และโปรตีนทั้งสองมีแม่ลายที่ผิดปกติ: 4HB ที่มีพื้นผิวขดลวดสามเหลี่ยมและแม่ลาย CXXC ที่เชื่อมโยงกับไดซัลไฟด์คู่หนึ่งเราเสนอว่าตอนนี้ IZUMO1 และ SPACA6 กำหนด superfamily โปรตีนที่มีขนาดใหญ่กว่าและมีโครงสร้างที่เกี่ยวข้องกับโปรตีนฟิวชั่น gameteด้วยการใช้คุณลักษณะเฉพาะของซูเปอร์แฟมิลี เราได้ทำการค้นหาโปรตีโอมที่มีโครงสร้างของมนุษย์ AlphaFold อย่างถี่ถ้วน โดยระบุสมาชิกเพิ่มเติมของซูเปอร์แฟมิลีนี้ รวมถึงสมาชิกหลายคนที่เกี่ยวข้องกับการผสมเซลล์สืบพันธุ์และ/หรือการปฏิสนธิตอนนี้ปรากฏว่ามีการพับโครงสร้างทั่วไปและซูเปอร์แฟมิลี่ของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการหลอมรวมของเซลล์สืบพันธุ์ และโครงสร้างของเราได้จัดทำแผนที่โมเลกุลของลักษณะที่สำคัญของกลไกการหลอมรวมของเซลล์สืบพันธุ์ของมนุษย์
SPACA6 เป็นโปรตีนเมมเบรนผ่านครั้งเดียวที่มีไกลแคนที่เชื่อมโยงกับ N หนึ่งตัวและพันธะไดซัลไฟด์สมมุติหกตัว (รูปที่ S1a และ S2)เราแสดงโดเมนนอกเซลล์ของมนุษย์ SPACA6 (สารตกค้าง 27–246) ในเซลล์ Drosophila S2 และทำให้โปรตีนบริสุทธิ์โดยใช้ความสัมพันธ์ของนิกเกิล การแลกเปลี่ยนไอออนบวก และโครมาโทกราฟีแบบแยกขนาด (รูปที่ S1b)ectodomain SPACA6 บริสุทธิ์มีความเสถียรและเป็นเนื้อเดียวกันมากการวิเคราะห์โดยใช้โครมาโทกราฟีแบบแยกขนาดรวมกับการกระเจิงแสงแบบเหลี่ยม (SEC-MALS) เผยให้เห็นจุดสูงสุดหนึ่งจุดโดยมีน้ำหนักโมเลกุลที่คำนวณได้ที่ 26.2 ± 0.5 kDa (รูปที่ S1c)สิ่งนี้สอดคล้องกับขนาดของ ectodomain โมโนเมอร์ SPACA6 ซึ่งบ่งชี้ว่าโอลิโกเมอไรเซชันไม่ได้เกิดขึ้นในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์นอกจากนี้ สเปกโทรสโกปีแบบวงกลมไดโครอิซึม (CD) เผยโครงสร้าง α/β แบบผสมที่มีจุดหลอมเหลว 51.3 °C (รูปที่ S1d,e)การสลายตัวของสเปกตรัมซีดีเผยให้เห็นองค์ประกอบα-helical 38.6% และองค์ประกอบ β-stranded 15.8% (รูปที่ S1d)
ectodomain ของ SPACA6 ถูกตกผลึกโดยใช้การเพาะเมทริกซ์แบบสุ่ม ส่งผลให้ชุดข้อมูลที่มีความละเอียด 2.2 Å (ตารางที่ 1 และรูปที่ S3)การใช้การรวมกันของการทดแทนโมเลกุลตามแฟรกเมนต์และข้อมูลการวางขั้นตอน SAD ที่มีการเปิดรับโบรไมด์สำหรับการกำหนดโครงสร้าง (ตารางที่ 1 และรูปที่ S4) แบบจำลองที่ได้รับการปรับปรุงขั้นสุดท้ายจะประกอบด้วยสารตกค้าง 27–246ในขณะที่กำหนดโครงสร้าง ไม่มีโครงสร้างทดลองหรือโครงสร้าง AlphaFold ที่พร้อมใช้งานectodomain ของ SPACA6 วัดได้ 20 Å × 20 Å × 85 Å ประกอบด้วยเจ็ดเอนริเก้และเก้า β-strand และมีรอยพับตติยภูมิที่ยาวขึ้นซึ่งมีความเสถียรโดยพันธะไดซัลไฟด์หกพันธะ (รูปที่ 1a, b)ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนที่อ่อนแอที่ส่วนท้ายของสายโซ่ด้านข้าง Asn243 บ่งชี้ว่าสารตกค้างนี้เป็นไกลโคซิเลชันที่เชื่อมโยงกับ Nโครงสร้างประกอบด้วยสองโดเมน: มัดสี่เกลียว N-terminal (4HB) และโดเมนคล้าย Ig ของ C-terminal ที่มีพื้นที่บานพับตรงกลางระหว่างพวกมัน (รูปที่ 1c)
โครงสร้างของโดเมนนอกเซลล์ของ SPACA6แผนภาพแถบของโดเมนนอกเซลล์ของ SPACA6 ซึ่งเป็นสีของสายโซ่ตั้งแต่ N ถึงปลาย C จากสีน้ำเงินเข้มถึงสีแดงเข้มซีสเตอีนที่เกี่ยวข้องกับพันธะไดซัลไฟด์จะถูกเน้นด้วยสีม่วงแดงb โทโพโลยีของโดเมนนอกเซลล์ของ SPACA6ใช้โทนสีเดียวกับในรูปที่ 1ac SPACA6 โดเมนนอกเซลล์แผนภูมิแถบโดเมน 4HB, แบบบานพับ และแบบ Ig มีสีส้ม สีเขียว และสีน้ำเงิน ตามลำดับเลเยอร์ไม่ได้ถูกวาดให้มีขนาด
โดเมน 4HB ของ SPACA6 ประกอบด้วยเอนริเก้หลักสี่อัน (เอนริเก้ 1–4) ซึ่งจัดเรียงในรูปแบบของเกลียวเกลียว (รูปที่ 2a) สลับระหว่างการโต้ตอบแบบขนานและแบบขนาน (รูปที่ 2b)เกลียวเลี้ยวเดี่ยวเพิ่มเติมขนาดเล็ก (เกลียว 1′) ถูกวางตั้งฉากกับมัด ก่อตัวเป็นรูปสามเหลี่ยมที่มีเอนริเก้ 1 และ 2 สามเหลี่ยมนี้มีรูปร่างผิดปกติเล็กน้อยในการห่อตัวแบบบิดเกลียวของขดลวดที่ค่อนข้างหนาแน่นของเอนริเก้ 3 และ 4 ( รูปที่ 2a)
แผนภูมิแถบขั้วต่อ N 4HBb มุมมองด้านบนของมัดของเกลียวสี่อัน แต่ละเกลียวเน้นด้วยสีน้ำเงินเข้มที่ปลาย N และสีแดงเข้มที่ปลาย Cc แผนภาพวงล้อเกลียวจากบนลงล่างสำหรับ 4HB โดยแต่ละสารตกค้างจะแสดงเป็นวงกลมที่มีป้ายกำกับด้วยรหัสกรดอะมิโนตัวอักษรตัวเดียวมีเพียงกรดอะมิโนสี่ตัวที่ด้านบนของวงล้อเท่านั้นที่ถูกระบุหมายเลขสารตกค้างที่ไม่มีขั้วจะมีสีเหลือง สารตกค้างที่ไม่มีประจุจะมีสีเขียว สารตกค้างที่มีประจุบวกจะให้สีฟ้า และสารตกค้างที่มีประจุลบจะให้สีแดงd ใบหน้าสามเหลี่ยมของโดเมน 4HB โดยมี 4HB เป็นสีส้มและบานพับเป็นสีเขียวสิ่งที่ใส่เข้าไปทั้งสองแสดงพันธะไดซัลไฟด์ที่มีรูปทรงแท่ง
4HB มีความเข้มข้นอยู่ที่แกนที่ไม่ชอบน้ำด้านในซึ่งประกอบด้วยเรซิดิวอะลิฟาติกและอะโรมาติกเป็นส่วนใหญ่ (รูปที่ 2c)แกนกลางมีพันธะไดซัลไฟด์ระหว่าง Cys41 และ Cys55 ที่เชื่อมโยงเอนริเก้ 1 และ 2 เข้าด้วยกันในรูปสามเหลี่ยมยกด้านบน (รูปที่ 2d)มีพันธะไดซัลไฟด์เพิ่มเติมอีกสองพันธะเกิดขึ้นระหว่างแม่ลาย CXXC ใน Helix 1 ′ และแม่ลาย CXXC อีกอันหนึ่งที่พบที่ส่วนปลายของกิ๊บในบริเวณบานพับ (รูปที่ 2d)อาร์จินีนตกค้างแบบอนุรักษ์นิยมที่มีฟังก์ชันที่ไม่รู้จัก (Arg37) ตั้งอยู่ภายในสามเหลี่ยมกลวงที่เกิดจากเอนริเก้ 1 ′, 1 และ 2 อะตอมคาร์บอนอะลิฟาติกCβ, CγและCδ Arg37 ทำปฏิกิริยากับแกนที่ไม่ชอบน้ำ และกลุ่ม guanidine ของมันจะเคลื่อนไหวแบบวัฏจักร ระหว่างเอนริเก้ 1 ′ และ 1 ผ่านการโต้ตอบระหว่างกระดูกสันหลังของ Thr32 และโซ่ด้านข้าง (รูปที่ S5a, b)Tyr34 ขยายเข้าไปในช่องโดยเหลือช่องเล็กๆ สองช่องไว้ ซึ่ง Arg37 สามารถโต้ตอบกับตัวทำละลายได้
โดเมนแซนวิชที่เหมือน Ig เป็น superfamily ขนาดใหญ่ของโปรตีนที่แบ่งปันคุณสมบัติทั่วไปของแผ่น amphipathic β-sheets แบบหลายเกลียวสองแผ่นขึ้นไปที่มีปฏิสัมพันธ์ผ่านแกนที่ไม่ชอบน้ำ 39 โดเมน C-terminal Ig-like ของ SPACA6 มีรูปแบบเดียวกัน และประกอบด้วยสองชั้น (รูปที่ S6a)แผ่นที่ 1 เป็นแผ่น β ที่มีสี่เส้น (เส้น D, F, H และ I) โดยที่เส้น F, H และฉันสร้างการจัดเรียงแบบต่อต้านขนาน และเส้น I และ D มีปฏิสัมพันธ์แบบขนานตารางที่ 2 เป็นแผ่นเบตาเกลียวคู่ขนานขนาดเล็ก (เส้น E และ G)พบพันธะไดซัลไฟด์ภายในระหว่างปลาย C ของโซ่ E และจุดศูนย์กลางของโซ่ H (Cys170-Cys226) (รูปที่ S6b)พันธะไดซัลไฟด์นี้คล้ายคลึงกับพันธะไดซัลไฟด์ในโดเมน β-แซนวิชของอิมมูโนโกลบุลิน40,41
แผ่น β สี่เกลียวบิดไปตามความยาวทั้งหมด ทำให้เกิดขอบที่ไม่สมมาตรซึ่งมีรูปร่างและไฟฟ้าสถิตต่างกันขอบที่บางกว่าเป็นพื้นผิวสิ่งแวดล้อมที่ไม่ชอบน้ำแบบแบนซึ่งโดดเด่นเมื่อเปรียบเทียบกับพื้นผิวที่ไม่เรียบและมีความหลากหลายทางไฟฟ้าสถิตที่เหลืออยู่ใน SPACA6 (รูปที่ S6b, c)รัศมีของกลุ่มคาร์บอนิล/อะมิโนของกระดูกสันหลังที่ถูกเปิดเผยและโซ่ด้านข้างที่มีขั้วล้อมรอบพื้นผิวที่ไม่ชอบน้ำ (รูปที่ S6c)ขอบที่กว้างขึ้นถูกปกคลุมด้วยส่วนลานที่ต่อยอดซึ่งปิดกั้นส่วน N-terminal ของแกนที่ไม่ชอบน้ำและสร้างพันธะไฮโดรเจนสามพันธะด้วยกลุ่มขั้วเปิดของกระดูกสันหลังของโซ่ F (รูปที่ S6d)ส่วนปลาย C ของขอบนี้ก่อให้เกิดช่องขนาดใหญ่ที่มีแกนที่ไม่ชอบน้ำบางส่วนที่ถูกเปิดออกกระเป๋าถูกล้อมรอบด้วยประจุบวกเนื่องจากอาร์จินีนตกค้างสามชุด (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 และ Arg212-Arg214) และฮิสทิดีนส่วนกลาง (His220) (รูปที่ S6e)
บริเวณบานพับเป็นส่วนสั้นๆ ระหว่างโดเมนขดลวดและโดเมนคล้าย Ig ซึ่งประกอบด้วย β-ชั้นสามเกลียวที่ขนานกันหนึ่งส่วน (สาย A, B และ C), เกลียว 310 ขนาดเล็ก และส่วนขดลวดสุ่มยาวหลายส่วน(รูปที่ S7)เครือข่ายของหน้าสัมผัสโควาเลนต์และไฟฟ้าสถิตในบริเวณบานพับดูเหมือนจะทำให้การวางแนวระหว่าง 4HB และโดเมนคล้าย Ig คงที่เครือข่ายสามารถแบ่งออกเป็นสามส่วนส่วนแรกประกอบด้วยลวดลาย CXXC สองแบบ (27CXXC30 และ 139CXXC142) ที่สร้างพันธะไดซัลไฟด์คู่หนึ่งระหว่างกิ๊บ β ในบานพับและเกลียว 1′ ใน 4HBส่วนที่สองประกอบด้วยปฏิกิริยาระหว่างไฟฟ้าสถิตระหว่างโดเมนที่คล้าย Ig และบานพับGlu132 ในบานพับก่อให้เกิดสะพานเกลือโดยมี Arg233 ในโดเมนคล้าย Ig และ Arg135 ในบานพับส่วนที่สามรวมถึงพันธะโควาเลนต์ระหว่างโดเมนที่คล้าย Ig และบริเวณบานพับพันธะไดซัลไฟด์สองตัว (Cys124-Cys147 และ Cys128-Cys153) เชื่อมต่อลูปส่วนพับกับตัวเชื่อมโยงที่ถูกทำให้เสถียรโดยอันตรกิริยาทางไฟฟ้าสถิตระหว่าง Gln131 และกลุ่มฟังก์ชันแกนหลัก ซึ่งยอมให้เข้าถึงโดเมนที่คล้าย Ig ตัวแรกโซ่.
โครงสร้างของ ectodomain SPACA6 และโครงสร้างส่วนบุคคลของโดเมน 4HB และ Ig-like ถูกนำมาใช้เพื่อค้นหาบันทึกที่มีโครงสร้างคล้ายกันในฐานข้อมูลโปรตีนเราระบุการจับคู่ที่มีคะแนน Dali Z สูง ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานเล็กน้อย และคะแนน LALI ขนาดใหญ่ (อย่างหลังคือจำนวนของสิ่งตกค้างที่เทียบเท่าเชิงโครงสร้าง)ในขณะที่การเข้าชม 10 ครั้งแรกจากการค้นหา ectodomain แบบเต็ม (ตาราง S1) มีคะแนน Z ที่ยอมรับได้ที่> 842 การค้นหาโดเมน 4HB หรือ Ig-like เพียงอย่างเดียวแสดงให้เห็นว่าการเข้าชมเหล่านี้ส่วนใหญ่สอดคล้องกับ β-แซนวิชเท่านั้นรอยพับที่พบได้ทั่วไปในโปรตีนหลายชนิดการค้นหาทั้งสามครั้งในต้าหลี่ให้ผลลัพธ์เพียงรายการเดียว: IZUMO1
มีการเสนอแนะมานานแล้วว่า SPACA6 และ IZUMO1 มีความคล้ายคลึงกันทางโครงสร้างร่วมกัน7,32,37แม้ว่า ectodomains ของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ gamete fusion ทั้งสองนี้จะแบ่งปันเอกลักษณ์ของลำดับเพียง 21% (รูปที่ S8a) แต่หลักฐานที่ซับซ้อนรวมถึงรูปแบบพันธะไดซัลไฟด์ที่อนุรักษ์ไว้และโดเมนที่คล้าย C-terminal Ig ที่คาดการณ์ไว้ใน SPACA6 อนุญาตให้มีความพยายามตั้งแต่เนิ่นๆ เพื่อสร้าง แบบจำลองที่คล้ายคลึงกันของเมาส์ A และ SPACA6 โดยใช้ IZUMO1 เป็นเทมเพลตโครงสร้างของเรายืนยันการคาดการณ์เหล่านี้และแสดงให้เห็นถึงระดับความคล้ายคลึงกันที่แท้จริงในความเป็นจริง โครงสร้าง SPACA6 และ IZUMO137,43,44 ใช้สถาปัตยกรรมสองโดเมนเดียวกัน (รูปที่ S8b) โดยมีโดเมน 4HB และ Ig-like β-sandwich ที่คล้ายกันซึ่งเชื่อมต่อกันด้วยขอบเขตบานพับ (รูปที่ S8c)
IZUMO1 และ SPACA6 4HB มีความแตกต่างจากมัดเกลียวทั่วไป4HB ทั่วไป เช่นเดียวกับที่พบในโปรตีนเชิงซ้อน SNARE ที่เกี่ยวข้องกับฟิวชั่นเอนโดโซม 45,46 มีระยะห่างเท่ากันเพื่อรักษาความโค้งคงที่รอบแกนกลาง 47 ในทางตรงกันข้าม โดเมนขดลวดในทั้ง IZUMO1 และ SPACA6 บิดเบี้ยว โดยมีความโค้งแปรผันและ การบรรจุไม่สม่ำเสมอ (รูปที่ S8d)การบิดตัวนี้อาจเกิดจากสามเหลี่ยมที่เกิดจากเอนริเก้ 1′, 1 และ 2 ยังคงอยู่ใน IZUMO1 และ SPACA6 และทำให้เสถียรด้วยมาตรฐาน CXXC เดียวกันบนเกลียว 1′อย่างไรก็ตาม พันธะไดซัลไฟด์เพิ่มเติมที่พบใน SPACA6 (Cys41 และ Cys55 โควาเลนต์ที่เชื่อมโยงเอนริเก้ 1 และ 2 ด้านบน) จะสร้างยอดที่คมชัดยิ่งขึ้นที่ยอดของสามเหลี่ยม ทำให้ SPACA6 บิดเบี้ยวมากกว่า IZUMO1 โดยมีสามเหลี่ยมช่องที่เด่นชัดมากกว่านอกจากนี้ IZUMO1 ยังขาด Arg37 ที่สังเกตพบในใจกลางของช่องนี้ใน SPACA6ในทางตรงกันข้าม IZUMO1 มีแกนที่ไม่ชอบน้ำโดยทั่วไปของสารตกค้างอะลิฟาติกและอะโรมาติก
IZUMO1 มีโดเมนที่คล้าย Ig ซึ่งประกอบด้วย β-sheet43 แบบเกลียวคู่และห้าเกลียวเส้นพิเศษใน IZUMO1 จะเข้ามาแทนที่ขดลวดใน SPACA6 ซึ่งทำปฏิกิริยากับเส้น F เพื่อจำกัดพันธะไฮโดรเจนของกระดูกสันหลังในเส้นดังกล่าวจุดเปรียบเทียบที่น่าสนใจคือประจุที่พื้นผิวที่คาดการณ์ไว้ของโดเมนที่คล้าย Ig ของโปรตีนทั้งสองชนิดพื้นผิว IZUMO1 มีประจุลบมากกว่าพื้นผิว SPACA6ประจุเพิ่มเติมจะตั้งอยู่ใกล้กับปลาย C ซึ่งหันหน้าไปทางเยื่อหุ้มอสุจิใน SPACA6 ภูมิภาคเดียวกันมีความเป็นกลางหรือมีประจุบวกมากกว่า (รูปที่ S8e)ตัวอย่างเช่น พื้นผิวที่ไม่ชอบน้ำ (ขอบที่บางกว่า) และหลุมที่มีประจุบวก (ขอบที่กว้างกว่า) ใน SPACA6 นั้นมีประจุลบใน IZUMO1
แม้ว่าความสัมพันธ์และองค์ประกอบโครงสร้างรองระหว่าง IZUMO1 และ SPACA6 จะได้รับการเก็บรักษาไว้อย่างดี แต่การจัดแนวโครงสร้างของโดเมนที่คล้าย Ig แสดงให้เห็นว่าทั้งสองโดเมนแตกต่างกันในการวางแนวทั่วไปที่สัมพันธ์กัน (รูปที่ S9)มัดเกลียวของ IZUMO1 โค้งรอบแซนด์วิช β ทำให้เกิดรูปร่าง "บูมเมอแรง" ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ที่ประมาณ 50° จากแกนกลางในทางตรงกันข้าม ลำแสงขดลวดใน SPACA6 นั้นเอียงไปประมาณ 10° ในทิศทางตรงกันข้ามความแตกต่างในการวางแนวเหล่านี้น่าจะเกิดจากความแตกต่างในบริเวณบานพับที่ระดับลำดับปฐมภูมิ IZUMO1 และ SPACA6 มีความคล้ายคลึงกันของลำดับเพียงเล็กน้อยที่ส่วนพับ ยกเว้นซิสเตอีน ไกลซีน และเรซิดิวของกรดแอสปาร์ติกเป็นผลให้พันธะไฮโดรเจนและโครงข่ายไฟฟ้าสถิตแตกต่างกันโดยสิ้นเชิงองค์ประกอบโครงสร้างรองของแผ่น β ถูกใช้ร่วมกันโดย IZUMO1 และ SPACA6 แม้ว่าสายโซ่ใน IZUMO1 จะยาวกว่ามากและ 310 helix (helix 5) มีลักษณะเฉพาะของ SPACA6ความแตกต่างเหล่านี้ส่งผลให้มีการวางแนวโดเมนที่แตกต่างกันสำหรับโปรตีนสองชนิดที่คล้ายกัน
การค้นหาเซิร์ฟเวอร์ต้าหลี่ของเราเปิดเผยว่า SPACA6 และ IZUMO1 เป็นเพียงสองโครงสร้างที่กำหนดจากการทดลองเท่านั้นที่จัดเก็บไว้ในฐานข้อมูลโปรตีนที่มีการพับ 4HB นี้โดยเฉพาะ (ตาราง S1)เมื่อเร็วๆ นี้ DeepMind (Alphabet/Google) ได้พัฒนา AlphaFold ซึ่งเป็นระบบที่ใช้โครงข่ายประสาทเทียมซึ่งสามารถทำนายโครงสร้างโปรตีน 3 มิติจากลำดับปฐมภูมิได้อย่างแม่นยำไม่นานหลังจากที่เราแก้ไขโครงสร้าง SPACA6 ฐานข้อมูล AlphaFold ก็ถูกปล่อยออกมา โดยให้แบบจำลองโครงสร้างการทำนายครอบคลุม 98.5% ของโปรตีนทั้งหมดในโปรตีโอมของมนุษย์การใช้โครงสร้าง SPACA6 ที่ได้รับการแก้ไขของเราเป็นแบบจำลองการค้นหา การค้นหาโครงสร้างที่คล้ายคลึงกันสำหรับแบบจำลองในโปรตีโอมมนุษย์ AlphaFold ระบุผู้สมัครที่มีความคล้ายคลึงทางโครงสร้างที่เป็นไปได้กับ SPACA6 และ IZUMO1ด้วยความแม่นยำอันเหลือเชื่อของ AlphaFold ในการทำนาย SPACA6 (รูปที่ S10a) - โดยเฉพาะ ectodomain 1.1 Å rms เมื่อเปรียบเทียบกับโครงสร้างที่ได้รับการแก้ไขของเรา (รูปที่ S10b) - เรามั่นใจได้ว่าการจับคู่ SPACA6 ที่ระบุนั้นน่าจะแม่นยำ
ก่อนหน้านี้ PSI-BLAST ค้นหาคลัสเตอร์ IZUMO1 ที่มีโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับอสุจิอีกสามชนิด: IZUMO2, IZUMO3 และ IZUMO450AlphaFold ทำนายว่าโปรตีนตระกูล IZUMO เหล่านี้จะพับกันเป็นโดเมน 4HB โดยมีรูปแบบพันธะไดซัลไฟด์เหมือนกับ IZUMO1 (รูปที่ 3a และ S11) แม้ว่าพวกมันจะไม่มีโดเมนที่คล้าย Ig ก็ตามมีการตั้งสมมติฐานว่า IZUMO2 และ IZUMO3 เป็นโปรตีนเมมเบรนด้านเดียวคล้ายกับ IZUMO1 ในขณะที่ IZUMO4 ดูเหมือนจะถูกหลั่งออกมายังไม่ได้กำหนดหน้าที่ของโปรตีน IZUMO 2, 3 และ 4 ในเซลล์สืบพันธุ์เป็นที่รู้กันว่า IZUMO3 มีบทบาทในการสร้างอะโครโซมทางชีวภาพในระหว่างการพัฒนาของตัวอสุจิ51 และโปรตีนของ IZUMO ก่อตัวเป็นสารเชิงซ้อน50การอนุรักษ์โปรตีน IZUMO ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม สัตว์เลื้อยคลาน และสัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำ แสดงให้เห็นว่าศักยภาพการทำงานของพวกมันสอดคล้องกับหน้าที่ของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเซลล์สืบพันธุ์ฟิวชันอื่นๆ ที่รู้จัก เช่น DCST1/2, SOF1 และ FIMP
แผนภาพของสถาปัตยกรรมโดเมนของซูเปอร์แฟมิลี IST โดยมีโดเมน 4HB, ส่วนพับ และโดเมนคล้าย Ig ที่เน้นด้วยสีส้ม เขียว และสีน้ำเงิน ตามลำดับIZUMO4 มีบริเวณเทอร์มินัล C ที่เป็นเอกลักษณ์ซึ่งมีลักษณะเป็นสีดำพันธะไดซัลไฟด์ที่ยืนยันและสมมุติจะแสดงเป็นเส้นทึบและเส้นประตามลำดับb IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) และ TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) จะแสดงในช่วงสีเดียวกับแผง A พันธะไดซัลไฟด์จะแสดงเป็นสีม่วงแดงไม่แสดงเอนริเก้ของทรานส์เมมเบรน TMEM95, IZUMO2 และ IZUMO3
ต่างจากโปรตีน IZUMO ตรงที่โปรตีน SPACA อื่นๆ (เช่น SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 และ SPACA9) คิดว่ามีโครงสร้างที่แตกต่างจาก SPACA6 (รูปที่ S12)มีเพียง SPACA9 เท่านั้นที่มี 4HB แต่ไม่คาดว่าจะมีการวางแนวขนานกันหรือมีพันธะไดซัลไฟด์เหมือนกันกับ SPACA6มีเพียง SPACA1 เท่านั้นที่มีโดเมนคล้าย Ig ที่คล้ายกันAlphaFold คาดการณ์ว่า SPACA3, SPACA4 และ SPACA5 มีโครงสร้างที่แตกต่างไปจาก SPACA6 อย่างสิ้นเชิงสิ่งที่น่าสนใจคือ SPACA4 เป็นที่รู้จักกันว่ามีบทบาทในการปฏิสนธิ แต่ในระดับที่มากกว่า SPACA6 แทนที่จะอำนวยความสะดวกในการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างสเปิร์มและโอโอไซต์ zona pellucida52
การค้นหา AlphaFold ของเราพบรายการที่ตรงกันอีกรายการหนึ่งสำหรับ IZUMO1 และ SPACA6 4HB, TMEM95TMEM95 ซึ่งเป็นโปรตีนเมมเบรนที่จำเพาะต่อสเปิร์มเพียงตัวเดียว ทำให้หนูตัวผู้มีบุตรยากเมื่อถูกกำจัด 32,33ตัวอสุจิที่ขาด TMEM95 มีสัณฐานวิทยาปกติ เคลื่อนที่ได้ และมีความสามารถในการทะลุผ่าน zona pellucida และจับกับเยื่อหุ้มไข่ แต่ไม่สามารถหลอมรวมกับเยื่อโอโอไซต์ได้การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า TMEM95 มีความคล้ายคลึงกันทางโครงสร้างกับ IZUMO133อันที่จริงโมเดล AlphaFold ยืนยันว่า TMEM95 เป็น 4HB ที่มีลวดลาย CXXC คู่เดียวกันกับ IZUMO1 และ SPACA6 และพันธะไดซัลไฟด์เพิ่มเติมแบบเดียวกันระหว่างเอนริเก้ 1 และ 2 ที่พบใน SPACA6 (รูปที่ 3a และ S11)แม้ว่า TMEM95 จะไม่มีโดเมนที่คล้าย Ig แต่ก็มีบริเวณที่มีรูปแบบพันธะไดซัลไฟด์คล้ายกับบริเวณบานพับ SPACA6 และ IZUMO1 (รูปที่ 3b)ในขณะที่ตีพิมพ์ต้นฉบับนี้ เซิร์ฟเวอร์ก่อนพิมพ์รายงานโครงสร้างของ TMEM95 เพื่อยืนยันผลลัพธ์ AlphaFold53TMEM95 นั้นคล้ายคลึงกับ SPACA6 และ IZUMO1 มาก และได้รับการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการในสัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำแล้ว (รูปที่ 4 และ S13)
การค้นหา PSI-BLAST ใช้ฐานข้อมูล NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP และ SOF1 เพื่อกำหนดตำแหน่งของลำดับเหล่านี้ในแผนภูมิต้นไม้แห่งชีวิตระยะห่างระหว่างจุดสาขาไม่แสดงตามมาตราส่วน
ความคล้ายคลึงกันของโครงสร้างโดยรวมที่โดดเด่นระหว่าง SPACA6 และ IZUMO1 แสดงให้เห็นว่าพวกเขาเป็นสมาชิกผู้ก่อตั้งของโครงสร้าง superfamily ที่ได้รับการอนุรักษ์ ซึ่งรวมถึงโปรตีน TMEM95 และ IZUMO 2, 3 และ 4สมาชิกที่รู้จัก: IZUMO1, SPACA6 และ TMEM95เนื่องจากมีสมาชิกเพียงไม่กี่รายเท่านั้นที่มีโดเมนที่มีลักษณะคล้าย Ig จุดเด่นของ superfamily IST ก็คือโดเมน 4HB ซึ่งมีคุณสมบัติพิเศษเฉพาะที่เหมือนกันกับโปรตีนเหล่านี้ทั้งหมด: 1) 4HB ขดที่มีเอนริเก้ที่จัดเรียงในการสลับกันแบบต่อต้านขนาน/ขนาน (รูปที่ . 5a) 2) มัดมีใบหน้าเป็นรูปสามเหลี่ยมซึ่งประกอบด้วยเอนริเก้สองอันภายในมัดและเกลียวแนวตั้งที่สาม (รูปที่ พื้นที่สำคัญ (รูปที่ 5c) เป็นที่ทราบกันว่ามาตรฐาน CXXC ที่พบในโปรตีนที่มีลักษณะคล้ายไทโอรีดอกซิน เป็นเซ็นเซอร์รีดอกซ์ 54,55,56 ในขณะที่มาตรฐานในสมาชิกในครอบครัว IST สามารถเชื่อมโยงกับไอโซเมอเรสของโปรตีนไดซัลไฟด์ เช่น ERp57 ในเซลล์สืบพันธุ์ บทบาทมีความเกี่ยวข้อง 57,58
สมาชิกของ IST มหาวงศ์ถูกกำหนดโดยลักษณะเฉพาะสามประการของโดเมน 4HB: เอนริเก้สี่อันที่สลับระหว่างการวางแนวขนานและขนานกัน หน้ามัดเกลียวแบบ ba-triangle และรูปแบบคู่ ca CXXC ที่เกิดขึ้นระหว่างโมเลกุลขนาดเล็ก) เกลียวที่ปลาย N (สีส้ม) และบริเวณบานพับ β-กิ๊บ (สีเขียว)
เมื่อพิจารณาถึงความคล้ายคลึงกันระหว่าง SPACA6 และ IZUMO1 ความสามารถของ SPACA6 ในการผูกกับ IZUMO1 หรือ JUNO จึงได้รับการทดสอบBiolayer Interferometry (BLI) เป็นวิธีการเชื่อมโยงแบบจลนศาสตร์ซึ่งก่อนหน้านี้เคยใช้ในการหาปริมาณอันตรกิริยาระหว่าง IZUMO1 และ JUNOหลังจากการฟักตัวของเซ็นเซอร์ที่มีฉลากไบโอตินโดยมี IZUMO1 เป็นเหยื่อที่มีความเข้มข้นสูงของสารวิเคราะห์ JUNO ก็ตรวจพบสัญญาณที่แรง (รูปที่ S14a) ซึ่งบ่งบอกถึงการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากการจับกันในความหนาของวัสดุชีวภาพที่ติดอยู่กับปลายเซ็นเซอร์สัญญาณที่คล้ายกัน (เช่น JUNO ควบคู่กับเซ็นเซอร์เป็นเหยื่อต่อสารวิเคราะห์ IZUMO1) (รูปที่ S14b)ตรวจไม่พบสัญญาณเมื่อใช้ SPACA6 เป็นตัววิเคราะห์กับ IZUMO1 ที่จับกับเซนเซอร์หรือ JUNO ที่จับกับเซนเซอร์ (รูปที่ S14a,b)การไม่มีสัญญาณนี้บ่งชี้ว่าโดเมนนอกเซลล์ของ SPACA6 ไม่มีการโต้ตอบกับโดเมนนอกเซลล์ของ IZUMO1 หรือ JUNO
เนื่องจากการทดสอบ BLI ขึ้นอยู่กับ biotinylation ของไลซีนอิสระที่ตกค้างบนโปรตีนของเหยื่อ การปรับเปลี่ยนนี้สามารถป้องกันการจับกันหากไลซีนตกค้างเกี่ยวข้องกับการโต้ตอบนอกจากนี้ การวางแนวของการจับที่สัมพันธ์กับเซนเซอร์สามารถสร้างอุปสรรคแบบสเตอริกได้ ดังนั้น การสอบวิเคราะห์แบบดึงลงแบบธรรมดาจึงถูกดำเนินการบนรีคอมบิแนนท์ SPACA6, IZUMO1 และ JUNO ectodomainsอย่างไรก็ตามเรื่องนี้ SPACA6 ไม่ได้ตกตะกอนด้วย IZUMO1 ที่ติดแท็กของเขาหรือ JUNO ที่ติดแท็กของเขา (รูปที่ S14c, d) ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีปฏิสัมพันธ์ที่สอดคล้องกับที่พบในการทดลอง BLIในฐานะกลุ่มควบคุมเชิงบวก เรายืนยันอันตรกิริยาของ JUNO ที่มีป้ายกำกับว่า IZUMO1 ของเขา (รูปที่ S14e และ S15)
แม้จะมีความคล้ายคลึงกันทางโครงสร้างระหว่าง SPACA6 และ IZUMO1 แต่การที่ SPACA6 ไม่สามารถผูก JUNO ก็ไม่น่าแปลกใจพื้นผิวของมนุษย์ IZUMO1 มีสารตกค้างมากกว่า 20 ชนิดที่ทำปฏิกิริยากับจูโน รวมถึงสารตกค้างจากแต่ละบริเวณทั้งสาม (แม้ว่าส่วนใหญ่จะอยู่ในบริเวณบานพับ) (รูปที่ S14f)ในบรรดาสารตกค้างเหล่านี้ มีเพียงหนึ่งชนิดเท่านั้นที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ใน SPACA6 (Glu70)ในขณะที่การทดแทนสารตกค้างจำนวนมากยังคงรักษาคุณสมบัติทางชีวเคมีดั้งเดิมไว้ แต่สารตกค้าง Arg160 ที่จำเป็นใน IZUMO1 ก็ถูกแทนที่ด้วย Asp148 ที่มีประจุลบใน SPACA6;การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ของ Arg160Glu ใน IZUMO1 เกือบจะยกเลิกการผูกมัดกับ JUNO43 เกือบทั้งหมดนอกจากนี้ ความแตกต่างในการวางแนวโดเมนระหว่าง IZUMO1 และ SPACA6 เพิ่มพื้นที่ผิวของไซต์ที่มีผลผูกพัน JUNO ของภูมิภาคที่เทียบเท่าบน SPACA6 อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ S14g)
แม้จะทราบความต้องการ SPACA6 สำหรับ gamete fusion และความคล้ายคลึงกับ IZUMO1 แต่ SPACA6 ดูเหมือนจะไม่มีฟังก์ชันการรวม JUNO ที่เทียบเท่ากันดังนั้นเราจึงพยายามรวมข้อมูลโครงสร้างของเราเข้ากับหลักฐานสำคัญที่ได้รับจากชีววิทยาวิวัฒนาการการจัดเรียงลำดับของความคล้ายคลึงกันของ SPACA6 แสดงให้เห็นถึงการอนุรักษ์โครงสร้างทั่วไปนอกเหนือจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมตัวอย่างเช่น มีซิสเตอีนตกค้างอยู่แม้ในสัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำที่อยู่ห่างไกล (รูปที่ 6a)การใช้เซิร์ฟเวอร์ ConSurf ข้อมูลการเก็บรักษาการจัดตำแหน่งหลายลำดับของ 66 ลำดับถูกแมปกับพื้นผิว SPACA6การวิเคราะห์ประเภทนี้สามารถแสดงให้เห็นว่าสารตกค้างใดได้รับการอนุรักษ์ไว้ในระหว่างการวิวัฒนาการของโปรตีน และสามารถระบุได้ว่าบริเวณผิวใดมีบทบาทในการทำงาน
การจัดเรียงลำดับของ ectodomains SPACA6 จาก 12 สปีชีส์ที่แตกต่างกันที่เตรียมโดยใช้ CLUSTAL OMEGAจากการวิเคราะห์ของ ConSurf ตำแหน่งที่อนุรักษ์นิยมที่สุดจะถูกทำเครื่องหมายด้วยสีน้ำเงินสารตกค้างซิสเตอีนจะถูกเน้นด้วยสีแดงขอบเขตโดเมนและองค์ประกอบโครงสร้างรองจะแสดงที่ด้านบนของการจัดตำแหน่ง โดยที่ลูกศรบ่งบอกถึงเส้น β และคลื่นบ่งบอกถึงเอนริเก้ตัวระบุการเข้าถึง NCBI ที่มีลำดับ ได้แก่ มนุษย์ (Homo sapiens, NP_001303901), แมนดริลล์ (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), ลิงคาปูชิน (Cebus mimic, XP_017359366), ม้า (Equus caballus, XP_023506102), วาฬเพชฌฆาต (Orcinus orca3_23 XP_03 2_034) .), แกะ (Ovis aries, XP_014955560), ช้าง (Loxodonta africana, XP_010585293), สุนัข (Canis lupus familyis, XP_025277208), เมาส์ (Mus musculus, NP_001156381), แทสเมเนียนเดวิล (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), Platypus, 8 ) , 61_89 และ อึ่งอ่าง (Bufo bufo, XP_040282113)การนับเลขจะขึ้นอยู่กับคำสั่งของมนุษย์b การแสดงพื้นผิวของโครงสร้าง SPACA6 โดยมี 4HB ที่ด้านบนและโดเมนคล้าย Ig ที่ด้านล่าง สีตามการประมาณการการอนุรักษ์จากเซิร์ฟเวอร์ ConSurfส่วนที่เก็บรักษาไว้ดีที่สุดจะเป็นสีน้ำเงิน ส่วนที่เก็บรักษาไว้ปานกลางจะเป็นสีขาว และส่วนที่เก็บรักษาไว้น้อยที่สุดจะเป็นสีเหลืองซีสเตอีนสีม่วงแผ่นพื้นผิวสามแผ่นที่แสดงให้เห็นถึงการป้องกันในระดับสูงจะแสดงอยู่ในแผ่นแทรกที่มีป้ายกำกับ 1, 2 และ 3 การ์ตูน 4HB จะแสดงในส่วนแทรกที่มุมขวาบน (รูปแบบสีเดียวกัน)
โครงสร้าง SPACA6 มีพื้นที่ผิวที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้สูงสามส่วน (รูปที่ 6b)แพตช์ 1 ครอบคลุม 4HB และบริเวณบานพับและมีสะพานไดซัลไฟด์ CXXC ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้สองตัว เครือข่ายบานพับ Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (รูปที่ S7) และสารตกค้างอะโรมาติกภายนอกที่ได้รับการอนุรักษ์สามตัว (Phe31, Tyr73, Phe137)ขอบที่กว้างขึ้นของโดเมนที่คล้าย Ig (รูปที่ S6e) ซึ่งแสดงถึงสารตกค้างที่มีประจุบวกหลายตัวบนพื้นผิวของอสุจิสิ่งที่น่าสนใจคือแพทช์นี้มีอีพิโทปแอนติบอดีที่เคยแสดงให้เห็นว่ารบกวนการทำงานของ SPACA6 30ภูมิภาคที่ 3 ครอบคลุมส่วนพับและด้านหนึ่งของโดเมนคล้าย Igภูมิภาคนี้มีโพรลีนแบบอนุรักษ์ (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) และสารตกค้างที่มีขั้ว/ประจุที่หันออกด้านนอกน่าประหลาดใจที่สารตกค้างส่วนใหญ่บนพื้นผิวของ 4HB มีความแปรปรวนสูง (รูปที่ 6b) แม้ว่ารอยพับจะถูกอนุรักษ์ไว้ตลอด SPACA6 ที่คล้ายคลึงกัน (ตามที่ระบุโดยการอนุรักษ์ของแกนมัดที่ไม่ชอบน้ำ) และนอกเหนือจาก IST superfamily
แม้ว่านี่จะเป็นขอบเขตที่เล็กที่สุดใน SPACA6 ที่มีองค์ประกอบโครงสร้างรองที่ตรวจพบได้น้อยที่สุด แต่ส่วนที่เหลือของส่วนบานพับจำนวนมาก (รวมถึงภูมิภาค 3) จะได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงในบรรดาความคล้ายคลึงกันของ SPACA6 ซึ่งอาจบ่งชี้ว่าการวางแนวของมัดเกลียวและ β-แซนวิช มีบทบาทในฐานะคนอนุรักษ์นิยมอย่างไรก็ตาม แม้จะมีพันธะไฮโดรเจนและเครือข่ายไฟฟ้าสถิตอย่างกว้างขวางในบริเวณบานพับของ SPACA6 และ IZUMO1 แต่หลักฐานของความยืดหยุ่นที่แท้จริงสามารถเห็นได้ในการจัดแนวโครงสร้างที่ได้รับอนุญาตหลายรายการของ IZUMO137,43,44การจัดตำแหน่งของแต่ละโดเมนซ้อนทับกันอย่างดี แต่การวางแนวของโดเมนที่สัมพันธ์กันนั้นแตกต่างกันไปตั้งแต่ 50° ถึง 70° จากแกนกลาง (รูปที่ S16)เพื่อทำความเข้าใจพลวัตเชิงโครงสร้างของ SPACA6 ในโซลูชัน ได้ทำการทดลอง SAXS (รูปที่ S17a, b)การสร้าง ectodomain ของ SPACA6 ใหม่โดยเริ่มต้นใหม่นั้นสอดคล้องกับโครงสร้างผลึกแบบแท่ง (รูปที่ S18) แม้ว่าพล็อต Kratky จะแสดงความยืดหยุ่นในระดับหนึ่ง (รูปที่ S17b)โครงสร้างนี้ตรงกันข้ามกับ IZUMO1 ซึ่งโปรตีนที่ไม่ถูกผูกไว้จะถือว่ามีรูปร่างบูมเมอแรงทั้งในแลตทิซและในสารละลาย
เพื่อระบุภูมิภาคที่ยืดหยุ่นโดยเฉพาะ ได้ทำการดำเนินการสเปกโทรสโกปีแลกเปลี่ยนไฮโดรเจน - ดิวเทอเรียม (H-DXMS) บน SPACA6 และเปรียบเทียบกับข้อมูลที่ได้รับก่อนหน้านี้ใน IZUMO143 (รูปที่ 7a, b)SPACA6 มีความยืดหยุ่นมากกว่า IZUMO1 อย่างชัดเจน ตามที่ระบุโดยการแลกเปลี่ยนดิวทีเรียมที่สูงกว่าทั่วทั้งโครงสร้างหลังจากการแลกเปลี่ยน 100,000 วินาทีในโครงสร้างทั้งสอง ส่วนปลาย C ของบริเวณบานพับแสดงการแลกเปลี่ยนในระดับสูง ซึ่งอาจทำให้เกิดการหมุนเวียนที่จำกัดของโดเมน 4HB และ Ig ที่สัมพันธ์กันสิ่งที่น่าสนใจคือส่วน C-terminal ของบานพับ SPACA6 ซึ่งประกอบด้วย 147CDLPLDCP154 ตกค้าง เป็นพื้นที่ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูง 3 (รูปที่ 6b) ซึ่งอาจบ่งชี้ว่าความยืดหยุ่นระหว่างโดเมนนั้นเป็นคุณสมบัติที่ได้รับการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการของ SPACA6จากการวิเคราะห์ความยืดหยุ่น ข้อมูลการหลอมด้วยความร้อนของ CD แสดงให้เห็นว่า SPACA6 (Tm = 51.2°C) มีความเสถียรน้อยกว่า IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (รูปที่ S1e และ S19)
ภาพ H-DXMS ของ SPACA6 และ b IZUMO1เปอร์เซ็นต์การแลกเปลี่ยนดิวทีเรียมถูกกำหนดหาที่จุดเวลาที่ระบุระดับการแลกเปลี่ยนไฮโดรเจน-ดิวทีเรียมระบุด้วยสีในระดับไล่ระดับจากสีน้ำเงิน (10%) ถึงสีแดง (90%)กล่องดำแสดงถึงพื้นที่ที่มีการแลกเปลี่ยนสูงขอบเขตของ 4HB, ส่วนพับและโดเมนคล้าย Ig ที่สังเกตพบในโครงสร้างผลึกแสดงไว้เหนือลำดับปฐมภูมิระดับการแลกเปลี่ยนดิวเทอเรียมที่ 10 วินาที, 1,000 วินาที และ 100,000 วินาทีถูกพล็อตบนแผนภูมิแถบที่ซ้อนทับบนพื้นผิวโมเลกุลโปร่งใสของ SPACA6 และ IZUMO1ส่วนของโครงสร้างที่มีระดับการแลกเปลี่ยนดิวทีเรียมต่ำกว่า 50% จะเป็นสีขาวพื้นที่ที่สูงกว่าการแลกเปลี่ยน H-DXMS 50% จะถูกให้สีในระดับเกรเดียนต์
การใช้ CRISPR/Cas9 และกลยุทธ์ทางพันธุกรรมที่ทำให้ล้มลงของยีนของหนูได้นำไปสู่การระบุปัจจัยหลายประการที่สำคัญสำหรับการจับตัวอสุจิและไข่และการหลอมรวมนอกเหนือจากปฏิสัมพันธ์ที่โดดเด่นของโครงสร้าง IZUMO1-JUNO และ CD9 แล้ว โปรตีนส่วนใหญ่ที่เกี่ยวข้องกับฟิวชั่น gamete ยังคงมีโครงสร้างและหน้าที่ลึกลับลักษณะทางชีวฟิสิกส์และโครงสร้างของ SPACA6 เป็นอีกชิ้นส่วนหนึ่งของปริศนาโมเลกุลการยึดเกาะ/ฟิวชั่นระหว่างการปฏิสนธิ
SPACA6 และสมาชิกอื่นๆ ของวงศ์ใหญ่ IST ดูเหมือนจะได้รับการอนุรักษ์ไว้สูงในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เช่นเดียวกับนก สัตว์เลื้อยคลาน และสัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำในความเป็นจริงเชื่อกันว่า SPACA6 จำเป็นสำหรับการปฏิสนธิในเซบีริช 59 ด้วยซ้ำ การกระจายนี้คล้ายกับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับฟิวชั่น gamete อื่น ๆ ที่รู้จักเช่น DCST134, DCST234, FIMP31 และ SOF132 ซึ่งบ่งบอกว่าปัจจัยเหล่านี้ขาด HAP2 (เช่น เรียกว่าโปรตีน GCS1) ซึ่งมีหน้าที่ในการเร่งปฏิกิริยาของผู้ประท้วงจำนวนมาก, พืช และสัตว์ขาปล้องฟิวชันโปรตีนที่ปฏิสนธิ 60, 61 แม้จะมีโครงสร้างที่คล้ายคลึงกันอย่างมากระหว่าง SPACA6 และ IZUMO1 แต่ยีนที่เข้ารหัสโปรตีนเหล่านี้อย่างใดอย่างหนึ่งล้มลงส่งผลให้เกิดภาวะมีบุตรยากในหนูตัวผู้ ซึ่งบ่งชี้ว่าการทำงานของพวกมันในการหลอมรวมเซลล์สืบพันธุ์นั้นไม่ซ้ำกัน.โดยทั่วไปแล้ว ไม่มีโปรตีนสเปิร์มที่ทราบที่จำเป็นสำหรับระยะการยึดเกาะของฟิวชันนั้นซ้ำซ้อน
ยังคงมีคำถามเปิดอยู่ว่า SPACA6 (และสมาชิกคนอื่นๆ ของ superfamily IST) มีส่วนร่วมในจุดเชื่อมต่อระหว่างเกมหรือไม่ สร้างเครือข่ายภายในเกมเพื่อคัดเลือกโปรตีนที่สำคัญไปยังจุดหลอมรวม หรือแม้แต่อาจทำหน้าที่เป็นฟิวโซเจนที่เข้าใจยากด้วยซ้ำการศึกษาการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันร่วมในเซลล์ HEK293T เปิดเผยปฏิสัมพันธ์ระหว่าง IZUMO1 แบบเต็มความยาวและ SPACA632อย่างไรก็ตาม ectodomains แบบรีคอมบิแนนท์ของเราไม่มีปฏิสัมพันธ์ ในหลอดทดลอง ซึ่งบ่งบอกว่าปฏิสัมพันธ์ที่เห็นใน Noda และคณะถูกลบทั้งคู่ในโครงสร้าง (สังเกตหางไซโตพลาสซึมของ IZUMO1 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าไม่จำเป็นสำหรับการปฏิสนธิ)อีกทางหนึ่ง IZUMO1 และ/หรือ SPACA6 อาจต้องการสภาพแวดล้อมการจับเฉพาะที่เราไม่ได้ทำซ้ำ ในหลอดทดลอง เช่น โครงสร้างที่จำเพาะทางสรีรวิทยาหรือสารเชิงซ้อนของโมเลกุลที่มีโปรตีนอื่น ๆ (ทราบหรือยังไม่ได้ค้นพบ)แม้ว่าเชื่อว่า ectodomain ของ IZUMO1 จะเป็นสื่อกลางในการเกาะตัวของอสุจิกับไข่ในพื้นที่ perivitelline แต่วัตถุประสงค์ของ ectodomain ของ SPACA6 ยังไม่ชัดเจน
โครงสร้างของ SPACA6 เผยให้เห็นพื้นผิวที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้หลายอย่างซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีนส่วนที่ได้รับการอนุรักษ์ของบริเวณบานพับที่อยู่ติดกับมาตรฐาน CXXC (กำหนด Patch 1 ด้านบน) มีสารอะโรมาติกที่หันออกด้านนอกหลายตัวซึ่งมักเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาที่ไม่ชอบน้ำและ π-ซ้อนระหว่างสารชีวโมเลกุลด้านกว้างของโดเมนที่คล้าย Ig (บริเวณที่ 2) ก่อให้เกิดร่องที่มีประจุบวกซึ่งมี Arg และสารตกค้างของเขาที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูง และก่อนหน้านี้แอนติบอดีต่อบริเวณนี้เคยถูกใช้เพื่อปิดกั้นเซลล์สืบพันธุ์ 30แอนติบอดีจดจำอีพิโทปเชิงเส้น 212RIRPAQLTHRGTFS225 ซึ่งมีอาร์จินีนเรซิดิวสามในหกตัวและ His220 ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงไม่ชัดเจนว่าความผิดปกตินี้เกิดจากการอุดตันของสารตกค้างเฉพาะเหล่านี้หรือทั่วทั้งภูมิภาคตำแหน่งของช่องว่างนี้ใกล้กับปลาย C ของแซนวิช β บ่งชี้ถึงปฏิกิริยาที่ถูกต้องกับโปรตีนอสุจิที่อยู่ใกล้เคียง แต่ไม่ใช่กับโปรตีนโอโอไซต์นอกจากนี้ การคงอยู่ของสายพันกันที่มีโพรลีนอุดมด้วยความยืดหยุ่นสูง (จุด 3) ภายในบานพับอาจเป็นตำแหน่งของอันตรกิริยาของโปรตีน-โปรตีน หรือมีแนวโน้มมากกว่าที่จะบ่งชี้ถึงการคงไว้ของความยืดหยุ่นระหว่างสองโดเมนเพศมีความสำคัญต่อบทบาทที่ไม่ทราบของ SPACA6การรวมกันของ gametes
SPACA6 มีคุณสมบัติเป็นโปรตีนการยึดเกาะระหว่างเซลล์ รวมถึง β-แซนด์วิชที่มีลักษณะคล้าย Igโปรตีนกาวหลายชนิด (เช่น แคดเธอริน อินทิกริน กาวซิน และ IZUMO1) มีโดเมน β-แซนวิชหนึ่งโดเมนหรือมากกว่านั้นที่ขยายโปรตีนจากเยื่อหุ้มเซลล์ไปยังเป้าหมายด้านสิ่งแวดล้อมโดเมนที่คล้าย Ig ของ SPACA6 ยังมีแม่ลายที่พบได้ทั่วไปในแซนวิช β ของการยึดเกาะและการทำงานร่วมกัน: เกลียวคู่ขนานที่ส่วนปลายของ β-แซนด์วิช หรือที่เรียกว่าแคลมป์เชิงกล66เชื่อกันว่ามาตรฐานนี้ช่วยเพิ่มความต้านทานต่อแรงเฉือน ซึ่งมีคุณค่าสำหรับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาระหว่างเซลล์อย่างไรก็ตาม แม้จะคล้ายคลึงกับสารยึดเกาะ แต่ในปัจจุบันยังไม่มีหลักฐานว่า SPACA6 มีปฏิกิริยากับไข่ขาวectodomain ของ SPACA6 ไม่สามารถจับกับ JUNO และเซลล์ HEK293T ที่แสดง SPACA6 ดังที่แสดงไว้ที่นี่ แทบจะไม่มีปฏิสัมพันธ์กับโอโอไซต์ที่ขาดโซน 32ถ้า SPACA6 สร้างพันธะระหว่างเกม ปฏิกิริยาเหล่านี้อาจต้องมีการดัดแปลงหลังการแปลหรือทำให้เสถียรโดยโปรตีนสเปิร์มอื่นๆเพื่อสนับสนุนสมมติฐานหลังนี้ อสุจิที่ขาด IZUMO1 จะจับกับโอโอไซต์ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าโมเลกุลอื่นที่ไม่ใช่ IZUMO1 มีส่วนเกี่ยวข้องในการยึดเกาะของ gamete ขั้นตอนที่ 27
ฟิวชันโปรตีนของไวรัส เซลล์ และพัฒนาการหลายชนิดมีคุณสมบัติที่ทำนายการทำงานของพวกมันในฐานะฟิวโซเจนตัวอย่างเช่น ไกลโคโปรตีนฟิวชันของไวรัส (คลาส I, II และ III) มีเปปไทด์ฟิวชันที่ไม่ชอบน้ำหรือลูปที่ส่วนท้ายของโปรตีนที่ถูกแทรกเข้าไปในเยื่อหุ้มโฮสต์แผนที่ความชอบน้ำของ IZUMO143 และโครงสร้าง (กำหนดและทำนายได้) ของซูเปอร์แฟมิลี IST แสดงให้เห็นว่าไม่มีเปปไทด์ฟิวชันที่ไม่ชอบน้ำปรากฏชัดเจนดังนั้น หากโปรตีนใดๆ ในซูเปอร์แฟมิลีของ IST ทำหน้าที่เป็นฟิวโซเจน พวกมันจะทำในลักษณะที่แตกต่างจากตัวอย่างอื่นๆ ที่ทราบ
โดยสรุป การทำงานของสมาชิกของ IST superfamily ของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการหลอมรวมของ gamete ยังคงเป็นปริศนาที่ยั่วเย้าโมเลกุลรีคอมบิแนนต์ SPACA6 ที่โดดเด่นของเราและโครงสร้างที่ได้รับการแก้ไขแล้วจะให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างที่ใช้ร่วมกันเหล่านี้กับบทบาทของพวกมันในการเกาะติดและหลอมรวมของเซลล์สืบพันธุ์
ลำดับ DNA ที่สอดคล้องกับ ectodomain SPACA6 ของมนุษย์ที่คาดการณ์ไว้ (หมายเลขภาคยานุวัติ NCBI NP_001303901.1; สารตกค้าง 27–246) ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการแสดงออกในเซลล์ Drosophila melanogaster S2 และสังเคราะห์เป็นส่วนของยีนที่มีลำดับการเข้ารหัส Kozak (Eurofins Genomics)สัญญาณการหลั่ง BiP และจุดสิ้นสุด 5 ′และ 3′ ที่สอดคล้องกันสำหรับการโคลนยีนที่ไม่ขึ้นกับ ligation ของยีนนี้ให้เป็นเวกเตอร์การแสดงออก pMT โดยยึดตามโปรโมเตอร์ metallothionein ที่ดัดแปลงสำหรับการเลือกด้วย puromycin (pMT-puro)เวกเตอร์ pMT-puro เข้ารหัสตำแหน่งการตัดแยกของทรอมบินตามด้วยแท็กปลาย C 10xHis (รูปที่ S2)
การเปลี่ยนถ่ายที่เสถียรของเวกเตอร์ SPACA6 pMT-puro ไปยังเซลล์ D. melanogaster S2 (Gibco) นั้นดำเนินการคล้ายกับโปรโตคอลที่ใช้สำหรับ IZUMO1 และ JUNO43เซลล์ S2 ถูกละลายและเติบโตในตัวกลางของชไนเดอร์ (Gibco) เสริมด้วยความเข้มข้นสุดท้ายที่ 10% (ปริมาตร/ปริมาตร) ซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ (Gibco) และยาปฏิชีวนะต้านเชื้อรา 1X (Gibco)เซลล์ทางเดินช่วงต้น (3.0 x 106 เซลล์) ถูกชุบในแต่ละหลุมของเพลต 6 หลุม (Corning)หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 27°C เซลล์ถูกทรานส์เฟกด้วยส่วนผสมของเวกเตอร์ SPACA6 pMT-puro 2 มก. และรีเอเจนต์การเปลี่ยนสถานะเอฟเฟคทีน (Qiagen) ตามเกณฑ์วิธีของผู้ผลิตเซลล์ที่ถูกทรานส์เฟกถูกบ่มเป็นเวลา 72 ชั่วโมงและจากนั้นเก็บเกี่ยวด้วยพิวโรมัยซิน 6 มก./มล.จากนั้นเซลล์จะถูกแยกออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อของชไนเดอร์ที่สมบูรณ์และวางไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Insect-XPRESS (Lonza) ที่ปราศจากซีรั่มเพื่อการผลิตโปรตีนขนาดใหญ่การเพาะเลี้ยงเซลล์ S2 ชุด 1 ลิตรถูกปลูกเป็นเซลล์ 8–10 × 106 มล.-1 ในขวดโพลีโพรพิลีน Erlenmeyer ก้นแบนที่มีการระบายอากาศ 2 ลิตร จากนั้นฆ่าเชื้อด้วยความเข้มข้นสุดท้าย 500 µM CuSO4 (มิลลิพอร์ ซิกมา) และกรองแบบปลอดเชื้อชักนำการเพาะเลี้ยงที่ถูกเหนี่ยวนำถูกบ่มที่ 27° C ที่ 120 รอบต่อนาทีเป็นเวลาสี่วัน
ตัวกลางที่มีการปรับสภาพซึ่งประกอบด้วย SPACA6 ถูกแยกออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 5660×กรัม ที่ 4°C ตามด้วยระบบการกรองการไหลในแนวสัมผัสของเซนทราเมต (Pall Corp) พร้อมด้วยเมมเบรน MWCO ขนาด 10 กิโลดาลตันใช้สื่อเข้มข้นที่มี SPACA6 กับคอลัมน์เรซิน Ni-NTA agarose (Qiagen) ขนาด 2 มล.เรซิน Ni-NTA ถูกล้างด้วยปริมาตร 10 คอลัมน์ (CV) ของบัฟเฟอร์ A และจากนั้น 1 CV ของบัฟเฟอร์ A ถูกเติมเพื่อให้ความเข้มข้นของอิมิดาโซลสุดท้ายคือ 50 มิลลิโมลาร์SPACA6 ถูกชะด้วยบัฟเฟอร์ A 10 มิลลิลิตรที่เสริมด้วยอิมิดาโซลจนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 500 มิลลิโมลาร์ทรอมบินประเภทจำกัด (มิลลิพอร์ ซิกมา) ถูกเติมโดยตรงไปยังท่อไดอะไลซิส (MWCO 12-14 กิโลดาลตัน) ที่ 1 ยูนิตต่อมิลลิกรัม SPACA6 เทียบกับ 1 ลิตร 10 มิลลิโมลาร์ ทริส-HCl, pH 7.5 และ 150 มิลลิโมลาร์ NaCl (บัฟเฟอร์ B) สำหรับการฟอกไต) ที่ 4°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมงจากนั้น SPACA6 ที่แยกด้วยทรอมบินถูกเจือจางสามเท่าเพื่อลดความเข้มข้นของเกลือและบรรจุลงในคอลัมน์แลกเปลี่ยนแคตไอออน MonoS 5/50 GL ขนาด 1 มล. (Cytiva/GE) ที่ปรับสมดุลด้วย Tris-HCl 10 มิลลิโมลาร์, pH 7.5ตัวแลกเปลี่ยนแคตไอออนถูกล้างด้วย Tris-HCl 10 มิลลิโมลาร์ 3 OK, pH 7.5 จากนั้น SPACA6 ถูกชะด้วยเกรเดียนต์เชิงเส้นตั้งแต่ 0 ถึง 500 มม. NaCl ใน Tris-HCl 10 มม., pH 7.5 สำหรับ 25 OKหลังจากโครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน SPACA6 จะถูกทำให้เข้มข้นเป็น 1 มิลลิลิตร และชะออกแบบไอโซแครตจากคอลัมน์ ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) ที่ปรับสมดุลด้วยบัฟเฟอร์ B ตามโครมาโตแกรม พูลและเศษส่วนเข้มข้นที่มี SPACA6ความบริสุทธิ์ถูกควบคุมโดยอิเล็กโทรโฟเรซิสย้อมสี Coomassie บนเจล SDS-โพลีอะคริลาไมด์ 16%ความเข้มข้นของโปรตีนถูกวัดปริมาณโดยการดูดกลืนแสงที่ 280 นาโนเมตรโดยใช้กฎเบียร์-แลมเบิร์ตและค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของฟันกรามตามทฤษฎี
SPACA6 บริสุทธิ์ถูกไดอะไลซ์ข้ามคืนกับ 10 มิลลิโมลาร์ โซเดียม ฟอสเฟต, pH 7.4 และ 150 มิลลิโมลาร์ NaF และเจือจางจนถึง 0.16 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ก่อนการวิเคราะห์โดย CD สเปกโทรสโกปีการสแกนสเปกตรัมของซีดีที่มีความยาวคลื่น 185 ถึง 260 นาโนเมตรถูกรวบรวมบนสเปกโตรโพลาริมิเตอร์ Jasco J-1500 โดยใช้คิวเวตต์ควอตซ์ที่มีความยาวเส้นทางแสง 1 มม. (เฮลมา) ที่ 25°C ที่อัตรา 50 นาโนเมตร/นาทีสเปกตรัม CD ได้รับการแก้ไขที่เส้นพื้นฐาน โดยมีค่าเฉลี่ยมากกว่า 10 การได้มา และแปลงเป็นรูปไข่ที่เหลือ (θMRE) ในหน่วยองศา cm2/dmol:
โดยที่ MW คือน้ำหนักโมเลกุลของแต่ละตัวอย่างใน DaN คือจำนวนกรดอะมิโนθ คือรูปไข่ในหน่วยมิลลิองศาd สอดคล้องกับความยาวของเส้นทางแสงเป็นซม.ความเข้มข้นของโปรตีนในหน่วย