ส่วนประกอบทางเคมีของท่อขดสแตนเลส 310 10 * 1 มม. โดเมน N-terminal ของสปิโดรอินสร้างไฮโดรเจลโดยใช้อะไมลอยด์ไฟบริลและเป็นแพลตฟอร์มสำหรับการตรึงโปรตีน

ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comคุณกำลังใช้เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่มีการรองรับ CSS แบบจำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
แถบเลื่อนแสดงสามบทความต่อสไลด์ใช้ปุ่มย้อนกลับและปุ่มถัดไปเพื่อเลื่อนไปตามสไลด์ หรือใช้ปุ่มตัวควบคุมสไลด์ที่ส่วนท้ายเพื่อเลื่อนไปตามแต่ละสไลด์

ข้อมูลจำเพาะ

310 10*1 มม. ซัพพลายเออร์ท่อขดสแตนเลส

องค์ประกอบทางเคมี

คุณสมบัติทางกล

โปรตีนไหมจากแมงมุมลูกผสม (โปรตีนไหมจากแมงมุม) มีศักยภาพในการนำไปประยุกต์ใช้มากมายในการพัฒนาวัสดุชีวภาพใหม่ แต่ลักษณะที่มีลักษณะต่อเนื่องหลายรูปแบบและมีแนวโน้มที่จะรวมกลุ่มกัน ทำให้ได้มายากและใช้งานง่ายที่นี่เรารายงานว่าโปรตีนสปิโดรอินขนาดเล็กรีคอมบิแนนท์และที่สำคัญคือโดเมน N-terminal (NT) นั้นสร้างไฮโดรเจลที่โปร่งใสและรองรับตัวเองได้อย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิ 37 ° Cฟิวชันโปรตีนที่ประกอบด้วย NT และโปรตีนเรืองแสงสีเขียวหรือพิวรีนนิวคลีโอไซด์ฟอสโฟรีเลสทำให้เกิดฟิวชันโปรตีนที่ทำงานได้อย่างสมบูรณ์ไฮโดรเจลผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า NT ชนิดลูกผสมและฟิวชันโปรตีนให้ผลผลิตในการแสดงออกที่สูง และช่วยให้ไฮโดรเจลมีคุณสมบัติที่น่าสนใจ เช่น ความโปร่งใส การเกิดเจลโดยไม่มีการเชื่อมโยงข้าม และการตรึงโปรตีนที่ออกฤทธิ์โดยตรงที่ความหนาแน่นสูง
แมงมุมมีต่อมไหมที่แตกต่างกันมากถึงเจ็ดชุด ซึ่งแต่ละชุดผลิตไหมเฉพาะประเภทไหมทั้งเจ็ดสายพันธุ์ประกอบด้วยโปรตีนไหมแมงมุม (สปิโดรอิน) ยาวประมาณ 6,000 สารตกค้าง และมีพื้นที่ซ้ำตรงกลางขนาดใหญ่ที่ล้อมรอบด้วยโดเมนทรงกลม N- และ C-terminal (NT และ CT)1,2ไหมประเภทที่มีการศึกษาอย่างกว้างขวางที่สุด ซึ่งก็คือ แอมพูลลาปฐมภูมิ ผลิตโดยต่อมแอมพูลลาปฐมภูมิในต่อมนี้ ชั้นเดียวของเซลล์เยื่อบุผิวจะสังเคราะห์โปรตีนสไปโดรอินและหลั่งโปรตีนเหล่านี้เข้าไปในรูของต่อม ซึ่งปรากฏอยู่ในรูปแบบที่ละลายน้ำได้ (โด๊ป) ที่ความเข้มข้นสูงมาก (30–50% w/v)3,4โครงสร้างและโครงสร้างของโปรตีนสปิโดรอินแอมพุลลาร์หลักในต่อมยังเป็นที่ถกเถียงกัน แต่หลักฐานการทดลองส่วนใหญ่บ่งชี้ว่ามีการมีรูปร่างเป็นเกลียวโดยทั่วไปและ/หรือแบบสุ่ม และโครงสร้างไมเซลล์หรือลาเมลลาร์ในขณะที่โดเมนที่ทำซ้ำจะควบคุมคุณสมบัติเชิงกลของเส้นใยไหม โดยสร้างนาโนคริสตัลแบบแผ่น β และโครงสร้างอสัณฐาน โดเมนสุดท้ายจะควบคุมเส้นใยไหมเพื่อตอบสนองต่อสภาวะที่เปลี่ยนแปลงไปตามต่อมไหมโดยการควบคุมการสร้างเส้นไหม 19. โดเมนเทอร์มินัลได้รับการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการ และการทำงานของพวกมันอาจเหมือนกันกับโปรตีนสไปโดรอินทั้งหมด 2,20,21ในระหว่างที่ผ่านต่อม ค่า pH ของสไปโดรอินจะลดลงจากประมาณ 7.6 เป็น < 5.716 และเพิ่มขึ้นตามแรงเฉือนและการยืดตัวที่เกิดจากการเคลื่อนที่ผ่านท่อที่ค่อยๆ แคบลงในสารละลาย CT เป็น dimer แบบขนานที่เป็นส่วนประกอบของ α-helical แต่เพื่อตอบสนองต่อ pH และแรงเฉือนต่ำ CT จะแผ่ออกและสลับ β-layers16, 17 ซึ่งอาจกระตุ้นให้เกิด β-layer ในพื้นที่ซ้ำของ Convert 16 NT เป็นโมโนเมอร์ภายใต้ สภาวะที่สะท้อนสภาวะในโพรงของต่อมและเป็นสื่อกลางในการละลายของสไปโดรอิน แต่ที่ pH ลดลง การโปรตอนของโซ่ด้านข้างของกรดคาร์บอกซิลิกจำนวนหนึ่งจะนำไปสู่การลดขนาดของ NT ด้วย pKa ที่ประมาณ 6.5 ดังนั้นจึงทำให้ NT มีเสถียรภาพและตรึงสปิโดรอินขนาดใหญ่ ปริมาณเครือข่าย16,18.ดังนั้น NT จึงมีบทบาทสำคัญในการสร้างเส้นใย โดยเปลี่ยนจากโมโนเมอร์ในการเคลือบไปเป็นไดเมอร์ในเส้นใยNT ยังคงละลายน้ำได้สูงและมีลักษณะเป็นเกลียวภายใต้ทุกสภาวะที่ศึกษาจนถึงปัจจุบัน 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 ซึ่งเป็นแรงบันดาลใจในการพัฒนาให้เป็นฉลากเพิ่มความสามารถในการละลายสำหรับการผลิตโปรตีนเฮเทอโรโลกัส
โปรตีนไหมแมงมุมชนิดรีคอมบิแนนต์ซึ่งประกอบด้วย NT หนึ่งตัว, บริเวณทำซ้ำสั้นๆ หนึ่งอัน, CT หนึ่งตัว และแท็ก His6 (His-NT2RepCT) สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ สามารถละลายได้ในบัฟเฟอร์ที่เป็นน้ำพอๆ กับโปรตีนไหมแมงมุมพื้นเมือง และเลียนแบบลักษณะสำคัญตามธรรมชาติของไหมแมงมุม .คุ้มครอง 25.31 น.His-NT2RepCT สามารถปั่นเป็นเส้นใยต่อเนื่องได้โดยใช้เครื่องชีวเลียนแบบ โดยอัดสารเคลือบที่ละลายน้ำได้ pH 8 ลงในอ่างน้ำ pH 525,32,33,34,35การหมักเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพของ E. coli ที่แสดง His-NT2RepCT และภายหลังการบำบัดส่งผลให้ได้ผลผลิต >14 กรัม/ลิตร หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ผลผลิตสูง ความสามารถในการละลายสูง และการตอบสนองที่เพียงพอของ His-NT2RepCT ต่อสภาวะที่เป็นกรดล้วนมาจาก NT23, 25, 34
ที่นี่เรารายงานการก่อตัวอย่างรวดเร็วของไฮโดรเจลโปร่งใสจากโปรตีนสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์ รวมถึง NT เพียงอย่างเดียว โดยการบ่มสารละลายโปรตีนที่อุณหภูมิ 37 °Cการใช้ไทโอฟลาวิน T เรืองแสง (ThT), การแปลงฟูริเยร์อินฟราเรดสเปกโทรสโกปี (FTIR), สเปกโทรสโกปีเรโซแนนซ์แม่เหล็กนิวเคลียร์ (NMR) และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) เราพบว่าโปรตีน NT และไมโครสไปเดอร์ผ่านการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเป็นแผ่น β และไฟบริลคล้ายอะไมลอยด์ เมื่อเจลเกิดขึ้นนอกจากนี้ โปรตีนฟิวชันของ NT และโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) หรือพิวรีนนิวคลีโอไซด์ฟอสโฟรีเลส (PNP) จะสร้างไฮโดรเจลที่มีชิ้นส่วนฟิวชันที่ทำงานได้อย่างสมบูรณ์การแสดงออกที่มีปริมาณงานสูงในโฮสต์ที่ต่างกัน ควบคู่ไปกับการก่อตัวอย่างรวดเร็วของไฮโดรเจลภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา เปิดความเป็นไปได้ในการผลิตไฮโดรเจลที่คุ้มต้นทุนพร้อมฟังก์ชันที่ได้รับการออกแบบ
ซึ่งแตกต่างจากโปรตีนสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์ที่มีการรายงานส่วนใหญ่36 His-NT2RepCT มีความเสถียรในบัฟเฟอร์ Tris-HCl ที่ pH 8 และสามารถทำให้เข้มข้นได้ถึง 500 มก./มล. โดยไม่มีฝน25ดังนั้นเราจึงรู้สึกประหลาดใจที่พบว่าโปรตีนนี้ก่อตัวเป็นไฮโดรเจลที่ชัดเจนและรองรับตัวเองได้อย่างรวดเร็วเมื่อบ่มที่อุณหภูมิ 37°C (รูปที่ 1b-d)การศึกษาเพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่าเจล His-NT2RepCT เกิดขึ้นในช่วงความเข้มข้นของโปรตีนที่หลากหลาย (10–300 มก. / มล.) และความเข้มข้นนี้มีความสัมพันธ์แบบผกผันกับเวลาเจล (รูปที่ 1c และรูปที่ 1 เพิ่มเติม)เพื่อค้นหาว่าส่วนใดของ His-NT2RepCT ที่เป็นสื่อกลางในการสร้างไฮโดรเจล จากนั้นเราได้ตรวจสอบแต่ละโดเมนแยกกันและในการรวมกันต่างๆ โดยใช้การทดสอบการผกผันของขวด (รูปที่ 1a, b)เศษส่วนที่ทดสอบทั้งหมดของเจลที่สร้างสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์ (ที่ความเข้มข้นของโปรตีน 300 มก./มล.) ในเวลาน้อยกว่า 1 ชั่วโมง ยกเว้น 2Rep ที่ตกตะกอน (รูปที่ 1b)สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า NT และ CT เพียงอย่างเดียว เมื่อรวมกันหรือเกี่ยวข้องกับการทำซ้ำ สามารถเจลได้ที่อุณหภูมิ 37°C และแท็ก His6 ไม่ส่งผลกระทบต่อกระบวนการนี้ในระดับที่มีนัยสำคัญใดๆเมื่อพิจารณาจากแนวคิดทั่วไปที่ว่า NT เป็นโปรตีนที่ละลายน้ำได้สูงและเสถียร และรายงานก่อนหน้านี้ของไฮโดรเจลสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์ได้ให้เหตุผลว่าผลของการเกิดเจลต่อการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในภูมิภาคที่ทำซ้ำและ/หรือ CTs NT เองก็สามารถทำได้การค้นพบเจลนั้นเป็นเรื่องที่ไม่คาดคิดตารางเสริม 1) 37, 38, 39 น่าสังเกตที่ NT จะเกิดเจลแล้วภายใน 10 นาทีที่ความเข้มข้น ≥ 300 มก./มล. (รูปที่ 1c)การทดลองการผกผันของขวดที่มีความเข้มข้นต่างๆ ของ NT แสดงให้เห็นว่าที่ >50 มก./มล. สารละลาย NT จะเกิดเจลเร็วกว่า His-NT2RepCT ที่ความเข้มข้นที่สอดคล้องกัน (w/v, รูปที่ 1c)
การแสดงแผนผังของโครงสร้างสไปโดรอินต่างๆ ที่ศึกษาในงานนี้b เวลาเจลที่ 37 °C สำหรับโปรตีนรีคอมบิแนนท์สปิโดรอินหลายชนิด (300 มก./มล.) ตรวจสอบโดยการกลับขวดCT gel ทันทีโดยไม่มีการฟักตัว (<300 มก./มล.) ทำให้ตกตะกอน 2Rep (300 มก./มล. สเกล 5 มม.)c เวลาเจลของ His-NT2RepCT และ NT ที่ความเข้มข้นของโปรตีนที่ระบุที่ 37°Cd รูปถ่ายของไฮโดรเจล His-NT2RepCT และ NT ที่มีสไปเดอร์และตัวอักษร “NT” พิมพ์อยู่ข้างใต้ ตามลำดับ (ทั้ง 200 มก./มล. สเกลบาร์ 5 มม.)
ไฮโดรเจลที่เกิดจากโปรตีนสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์หลายชนิดมีสีที่แตกต่างกันเล็กน้อย และการสังเกตด้วยตาเปล่าแสดงให้เห็นระดับความโปร่งใสที่แตกต่างกัน (รูปที่ 1b)เจล NT มีความชัดเจนเป็นพิเศษ ในขณะที่เจลอื่นๆ จะขุ่นเจล His-NT2RepCT และ NT ที่หล่อลงในท่อทรงกระบอกสามารถถอดออกจากแม่พิมพ์ได้อย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 1d)
เพื่อทดสอบว่าเจลเคลือบไหมแมงมุมธรรมชาติภายใต้สภาวะที่พบว่าก่อให้เกิดเจลของโปรตีนสไปโดรอินชนิดรีคอมบิแนนท์หรือไม่นั้น ได้มีการรวบรวมสารเคลือบจากต่อมแอมพูลลาขนาดใหญ่ของแมงมุมสะพานสวีเดน (Larinioides sclopetarius)การเคลือบถูกเก็บไว้ในบัฟเฟอร์ Tris-HCl 20 mM ที่ 50 มก. / มล. (ขึ้นอยู่กับน้ำหนักแห้งที่วัดได้) แต่ไม่พบการเกิดเจลในระหว่างการฟักตัว 21 วันที่ 37 ° C (รูปที่ 2a เพิ่มเติม)
ในการหาปริมาณเจลเหล่านี้ สามารถใช้การวัดทางรีโอโลจีเพื่อศึกษากระบวนการเกิดเจลและกำหนดคุณสมบัติทางกลโดยรวมได้โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การตรวจสอบโมดูลัสการกักเก็บ (ความยืดหยุ่น) ที่อุณหภูมิสูงขึ้นสามารถให้ข้อมูลเกี่ยวกับอุณหภูมิที่ทำให้เกิดเจลได้ตลอดจนคุณสมบัติความยืดหยุ่นหนืดของสารเคลือบการทดลองการเพิ่มอุณหภูมิ (โดยใช้ 1°C/นาทีที่ 25-45°C จากการศึกษาก่อนหน้านี้โดยใช้สารละลายสต๊อกไหมธรรมชาติ)40,41 แสดงให้เห็นว่าโมดูลัสการจัดเก็บของสารละลาย His-NT2RepCT และ NT เพิ่มขึ้นตามอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นเพิ่มขึ้น (รูปที่ 2 และรูปที่ 3 เพิ่มเติม)โดยเฉพาะอย่างยิ่ง โมดูล NT เริ่มเติบโตที่อุณหภูมิต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ His-NT2RepCT ซึ่งสอดคล้องกับเวลาเจลที่เร็วขึ้นที่สังเกตได้เมื่อ NT ถูกบ่มโดยตรงกับ His-NT2RepCT ที่ 37°C (รูปที่ 1)หลังจากอุณหภูมิลดลงในเวลาต่อมา โมดูลัสการจัดเก็บจะไม่กลับไปเป็นค่าที่ต่ำกว่าและยังคงอยู่เหนือโมดูลัสการสูญเสีย (ดูรูปที่ 3 เพิ่มเติม) ซึ่งบ่งชี้ถึงการเกิดเจลที่เสถียรโดยไม่สามารถกลับคืนสภาพด้วยความร้อนหลังจากการเจล โมดูลัสยืดหยุ่นสุดท้ายอยู่ระหว่าง 15 ถึง 330 kPa สำหรับไฮโดรเจล His-NT2RepCT ที่ความเข้มข้น 100–500 มก./มล. และโมดูลัสยืดหยุ่นสุดท้ายสำหรับไฮโดรเจล NT (100–500 มก./มล.) อยู่ระหว่าง 2 ถึง 1400 kPa (รูปที่ 2 และข้อมูลทางลาดที่สมบูรณ์) ดูรูปที่ 3 เพิ่มเติม)
a การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิในระหว่างการตรวจวัด His-NT2RepCT (300 มก./มล.) และ b NT (300 มก./มล.) พร้อมเขย่าลูกศรบ่งบอกถึงแนวโน้มของอุณหภูมิ และการแรเงาที่เบากว่าของข้อมูลโมดูลจัดเก็บข้อมูลแสดงถึงการทดสอบที่ค่าแรงบิดสำหรับเครื่องมือต่ำกว่าที่ผู้ผลิตกำหนด ซึ่งเป็นสาเหตุของเสียงรบกวนที่เพิ่มขึ้นc การสะสมส่วนปลายของ His-NT2RepCT และ NT หลังจากอุณหภูมิสูงขึ้น (100, 300 และ 500 มก./มล.)การอ่านโมดูลทั้งหมดจะดำเนินการที่ความถี่ 0.1 Hz
ในฐานะที่เป็นวิธีการที่มีศักยภาพในการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เกี่ยวข้องกับการเกิดเจล เราได้บันทึกสเปกตรัม FTIR ของ His-NT2RepCT และ NT ก่อนและหลังการเกิดเจลที่อุณหภูมิ 37°C (รูปที่ 3a, b)ตามที่คาดไว้ สเปกตรัมของสารละลาย His-NT2RepCT และ NT สอดคล้องกับโปรตีนที่แสดงโครงสร้างทุติยภูมิของขดลวด α-เกลียว/แบบสุ่ม โดยมีแถบเด่นชัดที่ 1,645 ซม.-1สำหรับไฮโดรเจลทั้งสอง การเกิดเจลส่งผลให้เกิดแขนสองข้างที่อยู่ตรงกลางของแถบ I ที่ประมาณ 1617 cm-1 และ 1695 cm-1 (รูปที่ 3a, b) ซึ่งบ่งบอกถึงการก่อตัวของโครงสร้างแผ่น β ที่ขนานกันการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้สามารถเห็นได้อย่างชัดเจนในสเปกตรัมอนุพันธ์อันดับสองและสเปกตรัมการเกิดเจลที่แตกต่างกัน (รูปที่ 4b เพิ่มเติม)แถบทั้งสองของชั้น NT β นั้นเด่นชัดมากกว่าแถบของ His-NT2RepCT ซึ่งบ่งชี้ว่าเนื้อหาทั้งหมดของแถบชั้น β ในไฮโดรเจล NT นั้นสูงกว่าของไฮโดรเจล NT2RepCT
สเปกตรัมการดูดกลืนแสง FTIR ของ His-NT2RepCT และ b NT (ทั้ง 500 มก./มล.) ก่อน (สารละลาย) และหลังการฟักตัว (เจล) ที่ 37°Cc ภาพ TEM ของเจล NT2RepCT 50 มก. / มล. ที่แขวนลอยใหม่และ d NTสเกลบาร์ 200 นาโนเมตรe เส้นผ่านศูนย์กลางของไฟเบอร์ของไฮโดรเจล His-NT2RepCT และ NTn = 100 ไฟบริลที่วัดได้, p < 0.0001แถบข้อผิดพลาดแสดงความเบี่ยงเบนมาตรฐานจุดศูนย์กลางของแถบค่าคลาดเคลื่อนคือค่าเฉลี่ยการทดสอบทีแบบไม่มีการจับคู่ (แบบสองด้าน) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติf ThT การเรืองแสงของโปรตีนสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์ต่างๆ (100 มก./มล.) ที่ 37 °C โดยไม่เขย่าg การทดลองปลูกเชื้อ NT (100 มก./มล.) จากเจล NT 100 มก./มล. พร้อมด้วยเมล็ด 0%, 5%, 10% และ 20%
การวิเคราะห์เจลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) แสดงให้เห็นว่าไฮโดรเจลประกอบด้วยไฟบริลคล้ายอะไมลอยด์ (รูปที่ 3c, 3d)ไฟบริลที่เกิดจาก NT นั้นยาวขึ้น (เส้นผ่านศูนย์กลาง 5–12 นาโนเมตร) และไม่มีการแยกส่วนในขณะที่ไฟบริล His-NT2RepCT มีความยาวสั้นกว่าและมีเส้นผ่านศูนย์กลางกว้างกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (7–16 นาโนเมตร) (รูปที่ 3e)ผลลัพธ์เหล่านี้ช่วยให้เราสามารถติดตามจลนพลศาสตร์ของพังผืดโดยใช้การทดสอบไทโอฟลาวิน T (ThT)สำหรับโปรตีนสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์ทั้งหมด สัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะเพิ่มขึ้นเมื่อตัวอย่างถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C (รูปที่ 3f, รูปที่ 5a เพิ่มเติม)สอดคล้องกับการค้นพบนี้ การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ของ NT และ His-NT2RepCT ภายใต้สภาวะการก่อเจลเผยให้เห็นการเพิ่มขึ้นสม่ำเสมอของการเรืองแสง ThT โดยไม่มีการสะสมรวมของ ThT-positive ในท้องถิ่นที่เห็นได้ชัดเจน (รูปที่ 5b, c เสริม)การก่อตัวของไฟบริลที่เป็นบวกของ ThT ไม่ได้มาพร้อมกับการเพิ่มขึ้นของ NT และความขุ่นของเขา-NTCT (รูปที่ 5d เสริม) ซึ่งหมายความว่าเครือข่ายของไฟบริลในเจลสามารถก่อตัวได้โดยไม่กระทบต่อความชัดเจนของเจลการเพาะโดยการเติมไฟบริลที่เตรียมไว้ล่วงหน้าจำนวนเล็กน้อยสามารถเร่งการก่อตัวของไฟบริลของอะไมลอยด์บางชนิดได้อย่างมีนัยสำคัญ42,43,44 แต่เพิ่ม NT 5%, 10% หรือ 20% (w/w) ลงในสารละลายของ NT hydrocoagulantsผลการเพาะ (รูปที่ 3g)บางทีนี่อาจเป็นเพราะความจริงที่ว่าไฟบริลในไฮโดรเจลนั้นค่อนข้างคงที่และไม่สามารถใช้เป็นเมล็ดได้
พฤติกรรมที่ไม่คาดคิดของโปรตีนสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์ที่อุณหภูมิสูงกระตุ้นให้เกิดการศึกษาสเปกโทรสโกปีด้วยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า (NMR) เพิ่มเติมเพื่อระบุการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เกี่ยวข้องกับการก่อตัวของเจลNMR spectra ของโซลูชัน His-NT2RepCT ที่บันทึกเมื่อเวลาผ่านไปที่ 37°C แสดงให้เห็นว่า CT ยังคงถูกพับบางส่วน ในขณะที่สัญญาณ NT และ 2Rep หายไป (รูปที่ 4a) บ่งบอกว่าส่วนใหญ่เป็น NT และ 2Rep ที่ควบคุมการก่อตัวของ His- ไฮโดรเจล NT2RepCTสัญญาณ CT ยังถูกลดทอนลงเหลือ 20% ของความเข้มดั้งเดิมของมันเช่นกัน โดยเสนอแนะว่า CT ส่วนใหญ่ได้รับการแก้ไขและรวมเข้าไว้ในโครงสร้างไฮโดรเจลเช่นกันสำหรับส่วนที่เล็กกว่าของ CT ซึ่งเคลื่อนที่ได้เหมือนกับในตัวอย่างที่บ่มไว้ล่วงหน้า และถูกสังเกตโดยสารละลาย NMR สเปกตรัมขาดสัญญาณสำหรับสิ่งตกค้างที่มีโครงสร้าง 10 รายการแรก อาจเกิดจากการตรึงส่วนที่ติดอยู่ของ His-NT2Rep ได้ยากสเปกตรัม NMR ของ -สถานะของไฮโดรเจล -NT2RepCT เผยให้เห็นการมีอยู่ที่โดดเด่นของ α-helices และ β-layer และในระดับที่น้อยกว่า โครงสร้างขดลวดแบบสุ่ม (รูปที่ 4b)การวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงทางเคมีของเมไทโอนีนที่ตกค้างอยู่ใน NT เท่านั้น แสดงให้เห็นว่าโดเมนนี้ถูกแปลงเป็นโครงสร้างแผ่น βสเปกตรัมที่ขึ้นกับเวลาของ NT ในสารละลายแสดงให้เห็นว่าความเข้มของสัญญาณลดลงสม่ำเสมอ (รูปที่ 4c) และ NMR โซลิดสเตตของไฮโดรเจล NT แสดงให้เห็นว่าสารตกค้าง NT ส่วนใหญ่ถูกแปลงเป็นโครงสร้างแผ่น β (รูปที่ 4d)ไม่สามารถกำหนดโครงสร้างของ 2Rep แยกกันได้เนื่องจากมีแนวโน้มที่จะรวมเข้าด้วยกันอย่างไรก็ตามสเปกตรัม NMR โซลิดสเตตของไฮโดรเจล NTCT และ His-NT2RepCT ดูคล้ายกันมาก (รูปที่ 4b; รูปที่ 6b เพิ่มเติม) ซึ่งบ่งชี้ว่า 2Rep มีส่วนช่วยเพียงเล็กน้อยต่อส่วนโครงสร้างของไฮโดรเจล His-NT2RepCTสำหรับ CT ไฮโดรเจล พบว่ามีα-helices, β-sheets และโครงสร้างทุติยภูมิแบบขดลวดแบบสุ่มอยู่ (รูปที่ 6d เพิ่มเติม)สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าบางส่วนของ CT ยังคงเป็น α-helices ในขณะที่ส่วนอื่น ๆ กลายเป็น β-sheetดังนั้น ผลลัพธ์ของ NMR spectroscopy ชี้ให้เห็นว่า NT มีความสำคัญต่อการสร้างไฮโดรเจล และยังแปลงเป็นโครงสร้างแผ่น β เมื่อหลอมรวมกับ 2Rep และ CTสอดคล้องกับสิ่งนี้ เมื่อเร็ว ๆ นี้เราพบว่าซิปเชิงพื้นที่ของอะไมลอยด์น่าจะก่อตัวขึ้นในทั้งห้าเอนริเก้ของโดเมน NT และอัลกอริธึม Waltz ทำนายภูมิภาคอะไมลอยด์เจนิกในเกลียว 1 (รูปที่ 4e)
สเปกตรัม 2 มิติของ 15N-HSQC 10 มก./มล. สารละลาย His-NT2RepCT ก่อน (สีน้ำเงิน) และ 19 ชั่วโมงหลังการฟักตัว (สีแดง) ที่ 37°Cพีคครอสส่วนบุคคลในสเปกตรัมสีแดงและ F24, G136, polyA ในสเปกตรัมสีน้ำเงินแสดงด้วยสัญลักษณ์กรดอะมิโนตัวอักษรตัวเดียวและหมายเลขเรซิดิวสิ่งที่ใส่เข้าไปแสดงการขึ้นอยู่กับความเข้มของสัญญาณตรงเวลาสำหรับสิ่งตกค้างที่เลือกจากโดเมน NT, 2Rep และ CTb สเปกตรัมความถี่วิทยุโซลิดสเตต (RFDR) ของไฮโดรเจล His-NT2RepCTความสัมพันธ์ของสารตกค้างCα / Cβที่สังเกตได้ในสเปกตรัม RFDR ถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบกับการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของเปปไทด์แบบจำลองและค่าที่ได้มาจากสถิติ และโครงสร้างรองSSB – แถบด้านข้างแบบหมุนได้c สเปกตรัมหนึ่งมิติของสารละลาย NT 15N-HSQC 10 มก./มล. ในระหว่างการฟักตัวที่ 37 °C เป็นเวลา 36 ชั่วโมงสิ่งที่ใส่เข้าไปจะแสดงความเข้มข้นเชิงปริมาตรเทียบกับเวลาd สเปกตรัม RFDR สถานะของแข็งของไฮโดรเจล NTระบุความสัมพันธ์ของสารตกค้าง Cα/Cβ และโครงสร้างรองที่สังเกตได้ในสเปกตรัม RFDRe อิงตามโปรไฟล์แนวโน้มภาวะกระตุกของ NT45.79 จากฐานข้อมูล Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/)พลังงานโรเซตตาของหน้าต่างการเปลี่ยนแปลงฟ้าผ่าเชิงพื้นที่ของเฮกซาเปปไทด์จะแสดงเป็นกิโลแคลอรี/โมลแถบสีแดงแสดงถึงเฮกซาเปปไทด์ที่มีแนวโน้มเกิดพังผืดสูง (พลังงานโรเซตตาต่ำกว่า -23 กิโลแคลอรี/โมล ใต้เส้นประ)แถบสีเขียวแสดงถึงชิ้นส่วนที่มีพลังงาน Rosetta สูงกว่าเกณฑ์ ดังนั้นจึงมีโอกาสน้อยที่จะเกิดซิปปิดชิ้นส่วนที่มีโพรลีนถูกแยกออกจากการวิเคราะห์ (ไม่มีคอลัมน์)สี่เหลี่ยมบ่งบอกถึงพื้นที่ของอะไมลอยโดซิสที่ทำนายโดยอัลกอริทึม Waltz81 (https://waltz.switchlab.org)ลำดับของกรดอะมิโนที่ตกค้างของ NT อยู่ที่ด้านบน และประเภทของสารตกค้างที่พบในโครงสร้างทุติยภูมิ β (กำหนดโดยสเปกโทรสโกปี NMR ของโซลิดสเตต) จะแสดงเป็นสีแดงตำแหน่งของ NT α-helices ทั้งห้าถูกกำหนดให้เป็น (H1-H5)28
ที่ pH <6.5 HT จะลดลง และทนทานต่อการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่เกิดจากความร้อนหรือยูเรีย18เพื่ออธิบายว่าการลดขนาดและความเสถียรของ NT ส่งผลต่อการเกิดเจลอย่างไร จึงควบคุมสารละลายที่มี NT 100 มก./มล. ที่ pH 8, 7 และ 6 โดยใช้การทดสอบการผกผันของขวดตัวอย่าง NT บ่มที่ pH 8 และ 7 เจลหลังจาก 30 นาทีที่ 37 °C แต่เจล pH 8 ยังคงใส ในขณะที่เจล pH 7 แสดงตะกอนที่มองเห็นได้ (รูปที่ 5a)ในทางตรงกันข้าม สารละลายที่มี HT ที่ pH 6 จะไม่ก่อตัวเป็นเจล และสามารถมองเห็นตะกอนขนาดใหญ่ได้หลังจากผ่านไป 20 นาทีที่ 37°Cสิ่งนี้แสดงให้เห็นว่าตัวไดเมอร์เองและ/หรือความเสถียรที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับโมโนเมอร์จะป้องกันการเกิดเจลไม่คาดว่าจะเกิดการก่อตัวของตะกอนสำหรับ NT ที่ pH 7 และ 6 เนื่องจากมีรายงานว่า NT ละลายได้ที่ 200 มก./มล.27 สามารถกลับคืนสภาพเดิมได้ง่ายหลังการสูญเสียความร้อน และยังรักษา α-helix ไว้ที่ค่าต่ำกว่าของ pH 18 คำอธิบายที่เป็นไปได้สำหรับความคลาดเคลื่อนเหล่านี้คือการทดลองที่รายงานก่อนหน้านี้ดำเนินการที่อุณหภูมิห้องหรือต่ำกว่า หรือที่ความเข้มข้นของโปรตีนที่ค่อนข้างต่ำ16,18,19
การทดสอบการผกผันของขวด NT (100 มก./มล.) ที่ pH 8, 7, 6 และ 154 mM NaCl (pH 8) หลังจากการฟักตัวที่ 37°Cb สเปกตรัม NT CD ที่มีและไม่มี NaF 154 mM และ NaCl 154 mM ตามลำดับรูปไข่ของฟันกรามที่ 222 นาโนเมตรจะถูกแปลงเป็นสัดส่วนของรอยพับตามธรรมชาติการสอบวิเคราะห์การผกผันของ c NT (100 มก./มล.) NT* (37 °C และ 60 °C), NTA72R (37 °C) และ His-NT-L6 (37 °C และ 60 °C)d สเปกตรัมซีดีของ NT กลายพันธุ์ NT*, NTA72R และ His-NT-L6รูปไข่ของฟันกรามที่ 222 นาโนเมตรจะถูกแปลงเป็นสัดส่วนของรอยพับตามธรรมชาติe การทดสอบการผกผันของ NTFlSp, NTMiSp และ NTMiSp ที่ลดลง (100 มก./มล.)สเกลบาร์ 5 มม.f สเปกตรัมซีดีของ NT, NTFlSp, NTMiSp และลด NTMiSpรูปไข่ของฟันกรามที่ 222 นาโนเมตรจะถูกแปลงเป็นสัดส่วนของรอยพับตามธรรมชาติสเปกตรัม NT เต็มรูปแบบที่ 25 °C และ 95 °C แสดงในรูปที่ 8 เพิ่มเติม
ความเข้มข้นของเกลือทางสรีรวิทยาเป็นตัวกำหนดปฏิกิริยาระหว่างไฟฟ้าสถิตระหว่างหน่วยย่อย NT และการลดขนาดของการถ่ายโอน NT ไปที่ pH18 ที่ต่ำกว่าเราพบว่าการมีอยู่ของ NaCl และ NaF 154 mM ยับยั้งการเกิดเจลได้อย่างแน่นอนตามลำดับ (รูปที่ 5a, b; รูปที่ 2b เพิ่มเติม) และเกลือเหล่านี้เพิ่มเสถียรภาพทางความร้อนของโมโนเมอร์ NT (รูปที่ 5b, รูปที่ 8 เพิ่มเติม) .นอกจากนี้ยังชี้ให้เห็นว่าการเพิ่มความคงตัวป้องกันการเกิดเจล แทนที่จะลดขนาดลง
เพื่อสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับบทบาทของการลดขนาดโปรตีนและความคงตัวในการเกิดเจล เราใช้สารกลายพันธุ์สองตัวคือ NT* และ NTA72R ซึ่งยังคงเป็นโมโนเมอร์ที่ pH ต่ำ 28.30NT* เป็นการกลายพันธุ์แบบกลับประจุสองเท่าโดยการกระจายประจุแบบไดโพลาร์ที่ปรากฏของโมโนเมอร์จะแบนราบ ซึ่งป้องกันการเกิดไดเมอไรเซชันและเพิ่มเสถียรภาพของโมโนเมอร์อย่างมากNTA72R เป็นไดโพลที่มีประจุ แต่ Ala แทนที่ Arg ตั้งอยู่ที่ขอบเขต dimer ดังนั้นการกลายพันธุ์จึงรบกวนการโต้ตอบของหน่วยย่อยที่จำเป็นสำหรับการลดขนาดเมื่อฟักตัวที่ 37°C NT* จะไม่ก่อรูปไฮโดรเจล ในขณะที่ NTA72R ก่อรูปเจลทึบแสงเป็นเวลา 15 นาที (รูปที่ 5c)เนื่องจากทั้ง NT* และ NTA72R ไม่สามารถลดขนาดได้ แต่มีความเสถียรของโมโนเมอร์ต่างกัน (รูปที่ 5d) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าความเสถียรทางอุณหพลศาสตร์สูงจะป้องกันไม่ให้ NT เกิดเจลสิ่งนี้ยังได้รับการสนับสนุนจากข้อเท็จจริงที่ว่า HT* ก่อตัวเป็นเจลเมื่อไม่เสถียรที่อุณหภูมิสูง (หลังจาก 8 นาทีที่ 60°C; รูปที่ 5c)ก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าปริมาณเมไทโอนีนในปริมาณสูงใน NT จะทำให้การพับตามธรรมชาติของมันกลายเป็นของเหลว และสารทดแทน Met to Leu จำนวน 6 ชนิด (ในที่นี้เรียกว่า His-NT-L6) ทำให้โมโนเมอร์ NT46 มีความเสถียรอย่างมากจากสมมติฐานที่ว่าจำเป็นต้องมีความยืดหยุ่นของโครงสร้างสำหรับการสร้าง NT gel เราพบว่าการกลายพันธุ์ที่เสถียร His-NT-L6 ไม่ได้เกิดเจลที่อุณหภูมิ 37 ° C (รูปที่ 5c, d)อย่างไรก็ตาม His-NT-L6 ยังก่อตัวเป็นเจลเมื่อฟักที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 60 นาที (รูปที่ 5c)
ความสามารถของ NT ในการแปลงสภาพเป็นโครงสร้างแผ่น β และก่อตัวเป็นไฮโดรเจลดูเหมือนจะใช้ได้กับโดเมน NT ของสไปโดรอินบางส่วนแต่ไม่ใช่ทั้งหมดNTs จากไหมประเภทต่างๆ และสไปเดอร์สายพันธุ์ Trichonophila clavipes (NTFlSp) ก่อตัวเป็นเจลแม้จะมีปริมาณเมไทโอนีนค่อนข้างต่ำและมีความเสถียรทางความร้อนสูง (รูปที่ 5e, f และตารางเสริม 2)ในทางตรงกันข้าม NT จาก spidroin โปรตีน ampullar ขนาดเล็กจาก Araneus ventricosus (NTMiSp) ที่มีเสถียรภาพทางความร้อนต่ำและมีปริมาณเมไทโอนีนสูงไม่ได้ก่อให้เกิดไฮโดรเจล (ตารางเสริม 2 และรูปที่ 5e, f)อย่างหลังอาจเกี่ยวข้องกับการมีอยู่ของพันธะไดซัลไฟด์ภายในโมเลกุล29,47อย่างสม่ำเสมอ เมื่อพันธะไดซัลไฟด์ของ NTMiSp ลดลง จะเกิดไฮโดรเจลหลังจากการบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 10 นาที (รูปที่ 5e)โดยสรุป ควรสังเกตว่าความยืดหยุ่นของโครงสร้างเป็นสิ่งสำคัญ แต่ไม่ใช่เพียงเกณฑ์เดียวสำหรับการก่อตัวของเจลจาก NTอีกปัจจัยที่อาจเกี่ยวข้องคือแนวโน้มที่จะก่อตัวไฟบริลอะไมลอยด์ และการวิเคราะห์ด้วยฐานข้อมูลซิปและอัลกอริธึม Waltz ได้แสดงให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่างความสามารถในการสร้างเจลและการมีอยู่ของบริเวณอะไมลอยด์เจนิก เช่นเดียวกับขอบเขตของภูมิภาคที่คาดการณ์ไว้ เพื่อสร้างซิปสเตอริคมีความสัมพันธ์กัน (ตารางเสริม 2 และรูปที่ 9 เพิ่มเติม)
ความสามารถของ NT ในการสร้างไฟบริลและสร้างเจลภายใต้สภาวะที่เอื้ออำนวยทำให้เราตั้งสมมติฐานว่าการหลอม NT กับชิ้นส่วนโปรตีนอื่น ๆ ยังคงสามารถสร้างเจลที่มีฟังก์ชั่นเต็มรูปแบบของคู่ฟิวชั่นได้เพื่อทดสอบสิ่งนี้ เราได้แนะนำโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) และพิวรีนนิวคลีโอไซด์ฟอสโฟรีเลส (PNP) ที่ปลาย C ของ NT ตามลำดับฟิวชันโปรตีนที่ได้ผลลัพธ์ถูกแสดงออกในเชื้อ E. coli ที่ให้ผลตอบแทนสุดท้ายที่สูงมาก (การเพาะเลี้ยงในขวดเขย่า 150 มก./ลิตร และ 256 มก./ลิตรสำหรับ His-NT-GFP และ His-NT-PNP ตามลำดับ) ซึ่งสอดคล้องกับสิ่งที่แสดงไว้ สำหรับโปรตีนอื่น ๆ ที่หลอมรวมกับ NT Ref.30. ฟิวชันโปรตีน His-NT-GFP (300 มก./มล.) และ His-NT-PNP (100 มก./มล.) ก่อตัวเป็นเจลหลังจาก 2 ชั่วโมง 6.5 ชั่วโมงที่ 37°C และที่สำคัญ เศษส่วนของ GFP ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงสังเกตได้หลังการเกิดเจล โดยที่ >70% ของความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์เริ่มต้นที่เหลืออยู่หลังการเกิดเจล (รูปที่ 6a)ในการวัดกิจกรรม PNP ในสารละลายและเจล-NT-PNP ของเขา เราต้องเจือจางฟิวชันโปรตีนด้วย NT เนื่องจากการทำงานของเอนไซม์ของสารเตรียมบริสุทธิ์อยู่นอกช่วงการตรวจจับของการทดสอบที่ความเข้มข้นของการเกิดเจลเจลที่เกิดขึ้นจากส่วนผสมที่ประกอบด้วย His-NT-PNP 0.01 มก./มล. และ NT 100 มก./มล. คงไว้ซึ่ง 65% ของการทำงานของเอนไซม์เริ่มต้นของตัวอย่างที่บ่มไว้ล่วงหน้า (รูปที่ 6b)เจลยังคงสภาพเดิมในระหว่างการวัด (รูปที่ 10 เพิ่มเติม)
ความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์สัมพัทธ์ก่อนและหลังการเกิดเจลของ His-NT-GFP (300 มก./มล.) และขวดกลับด้านที่ประกอบด้วยไฮโดรเจล His-NT-GFP (300 มก./มล.) ภายใต้แสงที่มองเห็นได้และแสง UVคะแนนแสดงการวัดแต่ละรายการ (n = 3) แถบข้อผิดพลาดแสดงความเบี่ยงเบนมาตรฐานค่าเฉลี่ยจะแสดงที่กึ่งกลางของแถบข้อผิดพลาดb กิจกรรม PNP ได้มาจากการวิเคราะห์ฟลูออโรเมตริกโดยใช้สารละลายและเจลที่ประกอบด้วย NT (100 มก. / มล.) และส่วนผสมที่ประกอบด้วย 0.01 มก. / มล. his-NT-PNP และ 100 มก. / มล. ดอลลาร์ไต้หวันใหม่สิ่งที่ใส่เข้าไปแสดงขวดกลับด้านที่บรรจุไฮโดรเจลที่มี His-NT-PNP (แท่งขนาด 5 มม.)
ที่นี่ เรารายงานการก่อตัวของไฮโดรเจลจาก NT และโปรตีนสปิโดรอินรีคอมบิแนนท์อื่นๆ โดยการบ่มสารละลายโปรตีนที่อุณหภูมิ 37°C (รูปที่ 1)เราแสดงให้เห็นว่าเจลนั้นสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงของ α-helices เป็น β-layer และการก่อตัวของไฟบริลคล้ายอะไมลอยด์ (รูปที่ 3 และ 4)การค้นพบนี้เป็นเรื่องที่น่าแปลกใจเนื่องจาก NT เป็นมัดเกลียวห้าเกลียวทรงกลมขดที่ทราบกันดีว่ามีความสามารถในการละลายได้สูงมากและมีความเสถียรสูงที่ความเข้มข้น >200 มก./มล. ที่ 4°C เป็นเวลาหลายวัน27นอกจากนี้ NT จะพับตัวกลับทันทีหลังการสูญเสียความร้อนที่ความเข้มข้นของโปรตีนต่ำในหน่วย µMตามผลลัพธ์ของเรา การก่อตัวของไฟบริลต้องใช้ความเข้มข้นของโปรตีน >10 มก./มล. และอุณหภูมิที่สูงขึ้นเล็กน้อย (รูปที่ 1)สิ่งนี้สอดคล้องกับแนวคิดที่ว่าไฟบริลอะไมลอยด์สามารถก่อตัวได้จากโปรตีนที่พับเป็นทรงกลมซึ่งอยู่ในสถานะที่กางออกบางส่วนเนื่องจากความผันผวนของความร้อนภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา 48ตัวอย่างของโปรตีนที่ได้รับการแปลงสภาพนี้ ได้แก่ อินซูลิน 49,50, β2-ไมโครโกลบูลิน, ทรานสไธเรติน และไลโซไซม์ 51,52,53แม้ว่า NT จะเป็น α-helix ในสถานะดั้งเดิม แต่ประมาณ 65% ​​ของสายโซ่โพลีเปปไทด์เข้ากันได้กับการสร้างซิป steric (รูปที่ 4e) 45เนื่องจากโมโนเมอร์เคลื่อนที่ได้แบบไดนามิก จึงสามารถเปิดเผยบริเวณที่อาจเกิดอะไมลอยด์เจนิกเหล่านี้ได้ที่อุณหภูมิที่สูงขึ้นปานกลาง และที่ความเข้มข้นสูงของโปรตีนทั้งหมดสามารถเข้าถึงความเข้มข้นที่สำคัญสำหรับการก่อตัวของไฟบริลอะไมลอยด์ด้วยเหตุผลนี้ เราพบความสัมพันธ์เชิงลบระหว่างความเข้มข้นของสปิโดรอินและเวลาการเกิดเจล (รูปที่ 1c) และหากโครงสร้าง NT โมโนเมอร์มีความเสถียรโดยการกลายพันธุ์ (NT *, His-NT-L6) หรือโดยการเติมเกลือ สามารถป้องกัน การก่อตัวของไฮโดรเจล (รูปที่ 5)
ในกรณีส่วนใหญ่ ไฟบริลอะไมลอยด์จะหายไปจากสารละลายในรูปของตะกอน แต่ภายใต้เงื่อนไขบางประการ พวกมันสามารถเกิดไฮโดรเจลได้55,56,57โดยทั่วไปแล้วไฟบริลที่ก่อตัวเป็นไฮโดรเจลจะมีอัตราส่วนกว้างยาวสูงและสร้างเครือข่ายสามมิติที่เสถียรผ่านการพัวพันของโมเลกุล 55,58 ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ของเราสำหรับการเกิดไฮโดรเจล ในหลอดทดลอง โปรตีนมักจะถูกกางออกทั้งหมดหรือบางส่วน ตัวอย่างเช่น โดยการสัมผัสกับตัวทำละลายอินทรีย์ อุณหภูมิสูง (70–90°C) และ/หรือ pH ต่ำ (1.5–3.0)59,60,61,62ไฮโดรเจลสปิโดรอินที่อธิบายไว้ในที่นี้ไม่ต้องการการประมวลผลที่รุนแรง และพวกมันไม่ต้องการสารเชื่อมโยงข้ามเพื่อทำให้ไฮโดรเจลคงตัว
ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าสปิโดรอินทำซ้ำและ QD ซึ่งดูเหมือนว่าจะได้รับการสลับแผ่น β ระหว่างการปั่นไหม ก่อให้เกิดไฮโดรเจลเมื่อเปรียบเทียบกับการค้นพบของเรา เวลาในการฟักตัวและ/หรืออุณหภูมิการฟักจะนานกว่าหรือสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ ตามลำดับ และไฮโดรเจลที่ได้มักจะทึบแสง (รูปที่ 7 และตารางเสริม 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. นอกจากเวลาเจลที่รวดเร็วแล้ว NT ไฮโดรเจล >300 มก./มล. (30%) ยังมีประสิทธิภาพเหนือกว่าไฮโดรเจลโปรตีนไหมสไปเดอร์รีคอมบิแนนท์อื่นๆ ที่อธิบายไว้ทั้งหมด เช่นเดียวกับไฮโดรเจลธรรมชาติ เช่น เจลาติน อัลจิเนต (2%) วุ้น (0.5 % ) และคอลลาเจน(0.6%) (รูปที่ 7 และตารางเสริม 1 และ 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74
เวลาของเจลและโมดูลัสยืดหยุ่นของไฮโดรเจลในการศึกษานี้ถูกเปรียบเทียบกับไฮโดรเจลที่มีสไปโดรอินอื่นๆ และไฮโดรเจลธรรมชาติที่คัดเลือกมามีการอ้างอิงพร้อมกับคำอธิบายของสภาวะการเกิดเจลAPS แอมโมเนียมเปอร์ซัลเฟต อุณหภูมิห้องข้อมูล 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
ดูเหมือนว่าแมงมุมได้พัฒนาวิธีการป้องกันไม่ให้สไปดรอยเกิดเจลระหว่างการเก็บรักษาแม้ว่าโปรตีนจะมีความเข้มข้นสูงในต่อมไหม แต่บริเวณที่เกิดซ้ำขนาดใหญ่ที่เกี่ยวข้องกับโดเมนปลายทางหมายความว่าความเข้มข้นที่ปรากฏของ NT และ CT ในต่อมนั้นสอดคล้องกับประมาณ 10-20 มก./มล. ที่ขอบเขตของการศึกษานี้จำเป็นสำหรับการเกิดไฮโดรเจลที่สังเกตได้ในหลอดทดลองนอกจากนี้ความเข้มข้นของเกลือที่คล้ายกัน 16 ทำให้ NT มีความเสถียร เช่นเดียวกับในต่อมไหม (รูปที่ 5b)มีการศึกษาโครงสร้างของ NT ในไซโตโซลของ E. coli และพบว่ามีการพับเก็บแน่นกว่าเมื่อตรวจสอบ ในหลอดทดลอง ซึ่งบ่งชี้เพิ่มเติมว่าเกลือหรือปัจจัยอื่น ๆ ป้องกันการรวมตัวกัน ในร่างกายอย่างไรก็ตามความสามารถของ NT ในการแปลงเป็นไฟบริลแบบแผ่น อาจมีความสำคัญต่อการสร้างเส้นใย และควรได้รับการตรวจสอบในการศึกษาในอนาคต
นอกเหนือจากแง่มุมใหม่ของการเกิดไฟบริลและไฮโดรเจลที่คล้าย NT-amyloid ที่สังเกตได้ในการศึกษานี้ เรายังแสดงให้เห็นว่าปรากฏการณ์นี้อาจมีการประยุกต์ด้านเทคโนโลยีชีวภาพและชีวการแพทย์ (รูปที่ 8)เพื่อเป็นการพิสูจน์แนวคิด เราได้รวม NT เข้ากับ GFP หรือ PNP และแสดงให้เห็นว่าฟิวชันโปรตีนยังก่อตัวเป็นไฮโดรเจลเมื่อบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C และเศษส่วน GFP และ PNP ส่วนใหญ่ยังคงรักษากิจกรรมไว้หลังจากการเจล (รูปที่ 6)นิวคลีโอไซด์ฟอสโฟรีเลสเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาที่สำคัญในการสังเคราะห์นิวคลีโอไซด์อะนาล็อก ซึ่งทำให้การค้นพบของเราเกี่ยวข้องกับอุตสาหกรรมชีวเภสัชภัณฑ์แนวคิดในการแสดงฟิวชันโปรตีนที่ก่อตัวเป็นไฮโดรเจลโปร่งใสภายใต้สภาวะที่เอื้ออำนวยทำให้เกิดการสร้างไฮโดรเจลเชิงฟังก์ชันที่มีคุณสมบัติเอื้ออำนวยสำหรับการใช้งานที่หลากหลาย เช่น การตรึงเอนไซม์ การปล่อยยาแบบควบคุม และวิศวกรรมเนื้อเยื่อนอกจากนี้ NT และ NT* ยังเป็นเครื่องหมายการแสดงออกที่มีประสิทธิภาพ 30 ซึ่งหมายความว่า NT และตัวแปรต่างๆ ของมันสามารถนำมาใช้สำหรับการผลิตฟิวชันโปรตีนที่ละลายน้ำได้ปริมาณงานสูง และการสร้างโปรตีนเป้าหมายที่ถูกตรึงในไฮโดรเจล 3 มิติในเวลาต่อมา
NT สามารถละลายได้ มี α-ขดลวด และคงตัวที่ความเข้มข้นต่ำ (µM) และ 37°Cที่อุณหภูมิเดียวกัน แต่ที่ความเข้มข้นเพิ่มขึ้น (>10 มก./มล.) NT จะเกิดเป็นเจลที่ประกอบด้วยไฟบริลคล้ายอะไมลอยด์ฟิวชันโปรตีนของ NT ยังสร้างเจลไฟบริลลาร์ที่มีชิ้นส่วนฟิวชันที่ทำงานได้อย่างสมบูรณ์ ซึ่งช่วยให้โปรตีนต่างๆ ถูกตรึงไว้ในไฮโดรเจล 3 มิติโดยใช้ NTด้านล่าง: NT (PDB: 4FBS) และภาพประกอบของเครือข่ายไฟเบอร์และโครงสร้างโปรตีนที่เกี่ยวข้อง (สมมติและไม่ได้วาดเป็นขนาด, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb)
โครงสร้าง (ดูตารางเสริม 4 สำหรับรายการทั้งหมดรวมถึงลำดับกรดอะมิโน) ถูกโคลนเป็นพลาสมิด pT7 และเปลี่ยนเป็น E. coli BL21 (DE3)E. coli ที่มีพลาสมิดเชิงวิศวกรรมถูกปลูกในน้ำซุป Luria ที่เสริมด้วยคานามัยซิน (70 มก./ลิตร) และเติบโตข้ามคืนที่อุณหภูมิ 30°C และ 250 รอบต่อนาทีจากนั้นเพาะเชื้อ 1/100 ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB ที่มีคานามัยซินและเพาะเลี้ยงที่ 30°C และ 110 รอบต่อนาทีจนกระทั่ง OD600 ถึง 0.8สำหรับการศึกษา NMR แบคทีเรียถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อขั้นต่ำสุด M9 ซึ่งมี D-กลูโคส 13C (อัลดริช) 2 กรัม และแอมโมเนียมคลอไรด์ 15N 1 กรัม (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) สำหรับการติดฉลากโปรตีนด้วยไอโซโทปลดอุณหภูมิลงเหลือ 20 องศาเซลเซียส และกระตุ้นการแสดงออกของโปรตีนด้วย isopropylthiogalactopyranoside 0.15 mM (ความเข้มข้นสุดท้าย)หลังจากการแสดงออกโปรตีนข้ามคืน เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวที่ 7278×กรัม 4°ซ เป็นเวลา 20 นาทีเม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์, pH 8 และแช่แข็งจนกระทั่งใช้งานต่อไปเซลล์ที่ละลายแล้วถูก lysed โดยใช้เครื่องขัดขวางเซลล์ (เครื่อง TS series, Constant Systems Limited, England) ที่ 30 kPaจากนั้นไลซีนถูกปั่นแยกที่ 25,000 กรัม เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4°Cสำหรับ NTMiSp จากนั้นเพลเลตถูกแขวนลอยใหม่ใน 2 โมลาร์ยูเรีย, ทริส-HCl 20 มิลลิโมลาร์, pH 8 และโซนิคเป็นเวลา 2 นาที (เปิด/ปิด 2 วินาที, 65%) จากนั้นปั่นแยกอีกครั้งที่ 25,000 xg, 4° C ภายใน 30 นาทีส่วนลอยเหนือตะกอนถูกโหลดลงบนคอลัมน์ Ni-NTA ล้างด้วย Tris-HCl 20 mM, อิมิดาโซล 2 mM, pH 8 และสุดท้ายโปรตีนถูกชะด้วย Tris-HCl 20 mM, อิมิดาโซล 200 mM, pH 8 เพื่อสร้าง NT2RepCT และ NTCT การย่อย thrombin แนะนำไซต์ (ThrCleav) ระหว่าง His และ NTตำแหน่งที่แตกแยกของ Thrombin ยังมีอยู่ใน His-NT-ThrCleav-2Rep (สร้าง 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (สร้าง NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (สร้าง CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (สร้าง NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (สร้าง NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (สร้าง NTF1Sp) และ His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (สร้าง NTMiSp)โครงสร้างถูกย่อยด้วยทรอมบิน (1:1000) และไดอะไลซ์ข้ามคืนที่ 4° C ด้วยทริส-HCl 20 มิลลิโมลาร์, pH 8, โดยใช้เมมเบรนไดอะไลซิส Spectra/Por ที่มีขีดจำกัดน้ำหนักโมเลกุลที่ 6-8 กิโลดาลตันหลังจากการฟอกไต สารละลายจะถูกโหลดลงในคอลัมน์ Ni-NTA และรวบรวมน้ำทิ้งที่มีโปรตีนที่สนใจความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยการวัดการดูดกลืนแสง UV ที่ 280 นาโนเมตรโดยใช้สัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของโปรตีนแต่ละชนิด ยกเว้น NTF1Sp ซึ่งใช้การทดสอบแบบแบรดฟอร์ดตามเกณฑ์วิธีของผู้ผลิตความบริสุทธิ์ถูกกำหนดโดยเจลอิเล็กโตรโฟเรซิส SDS polyacrylamide (4–20%) และการย้อมสีน้ำเงินสดใสของ Coomassieโปรตีนถูกทำให้เข้มข้นโดยใช้ตัวกรองการหมุนเหวี่ยง (VivaSpin 20, GE Healthcare) ที่ 4000 xg โดยมีการตัดน้ำหนักโมเลกุล 10 kDa ในรอบ 20 นาที
ละลายสารละลายโปรตีนและปิเปต 150 µl อย่างระมัดระวังลงในขวดที่มีผนังกั้นชัดเจนขนาด 1 มล. (Thermo Scientific ขนาด 8 x 40 มม.)ท่อถูกปิดและปิดผนึกด้วยพาราฟิล์มเพื่อป้องกันการระเหยตัวอย่าง (n = 3) ถูกบ่มที่ 37°C หรือ 60°C และกลับด้านเป็นระยะๆ เพื่อสังเกตการเกิดเจลตัวอย่างที่ไม่เจลถูกบ่มเป็นเวลาอย่างน้อยหนึ่งสัปดาห์ลดพันธะไดซัลไฟด์ของ NTMiSp ด้วย 10 มิลลิโมลาร์ DTT ต่อโปรตีน 10 ไมโครโมลาร์เพื่อวิเคราะห์การเกิดเจลของสารเคลือบไหมแมงมุมธรรมชาติ แมงมุมสะพานสวีเดนถูกตัด ต่อมขยายหลอดเลือดหลักทั้งสองถูกวางไว้ในบัฟเฟอร์ Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์ pH 8 200 ไมโครลิตร และตัดเพื่อให้สารเคลือบแยกออกจากต่อม.เนื้อหาของต่อมจะละลายในบัฟเฟอร์ 50 µl สำหรับการหาน้ำหนักแห้ง (โดยการบ่มขวดแบบเปิดที่อุณหภูมิ 60 °C ถึงน้ำหนักคงที่) และ 150 µl สำหรับการเกิดเจลที่ 37 °C
รูปทรง/เครื่องมือในการวัดทำจากสแตนเลสโดยใช้แผ่นขนานที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางด้านบน 20 มม. และมีช่องว่าง 0.5 มม.อุ่นตัวอย่างตั้งแต่ 25 °C ถึง 45 °C และปรับอุณหภูมิกลับไปเป็น 25 °C ในอัตรา 1 °C ต่อนาทีโดยใช้เพลเทียร์ด้านล่างที่เป็นสเตนเลสสตีลการวัดการสั่นสะเทือนดำเนินการที่ความถี่ 0.1 เฮิรตซ์ และในบริเวณยืดหยุ่นหนืดเชิงเส้นของวัสดุที่ความเครียด 5% และ 0.5% สำหรับตัวอย่าง 100 มก./มล. และ 300–500 มก./มล. ตามลำดับใช้ห้องควบคุมความชื้นแบบกำหนดเองเพื่อป้องกันการระเหยวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ปริซึม 9
สำหรับการเก็บสเปกตรัมอินฟราเรด (IR) ที่อุณหภูมิห้องตั้งแต่ 800 ถึง 3900 ซม.–1อุปกรณ์ ATR รวมถึงเส้นทางแสงที่ผ่านสเปกโตรมิเตอร์ จะถูกไล่อากาศออกด้วยอากาศกรองแห้งก่อนและระหว่างการทดลองสารละลาย (500 มก./มล. เพื่อลดพีคการดูดซึมน้ำในสเปกตรัมให้เหลือน้อยที่สุด) ถูกปิเปตลงบนผลึก และเจล (500 มก./มล.) ถูกสร้างขึ้นก่อนการวัดและจากนั้นจึงถ่ายโอนไปยังคริสตัล (n = 3)บันทึกการสแกน 1,000 ครั้งด้วยความละเอียด 2 ซม.-1 และรอบการทำงานเป็นศูนย์ที่ 2 อนุพันธ์อันดับสองคำนวณโดยใช้ OPUS (Bruker) โดยใช้ช่วงการปรับให้เรียบที่เก้าจุดสเปกตรัมถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามขอบเขตการรวมเดียวกันระหว่าง 1720 ถึง 1580 cm-1 โดยใช้ F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”ในสเปกโทรสโกปี ATR-IR ความลึกของการเจาะทะลุของลำแสงอินฟราเรดเข้าไปในตัวอย่างจะขึ้นอยู่กับจำนวนคลื่น ส่งผลให้การดูดกลืนแสงที่หมายเลขคลื่นต่ำกว่ามีความเข้มข้นมากกว่าที่หมายเลขคลื่นที่สูงกว่าผลกระทบเหล่านี้ไม่ได้รับการแก้ไขสำหรับสเปกตรัมที่แสดงในรูปที่3 เนื่องจากมีขนาดเล็กมาก (รูปที่ 4 เพิ่มเติม)สเปกตรัมที่แก้ไขสำหรับตัวเลขนี้คำนวณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Bruker OPUS
โดยหลักการแล้ว การหาปริมาณที่ครอบคลุมของโครงสร้างโปรตีนเป็นไปได้หลังจากการแยกส่วนที่เชื่อถือได้ของส่วนประกอบภายในพีคเอไมด์ Iอย่างไรก็ตามในทางปฏิบัติก็มีอุปสรรคบางประการเกิดขึ้นสัญญาณรบกวนในสเปกตรัมอาจปรากฏเป็นจุดสูงสุด (เท็จ) ในระหว่างการแยกส่วนนอกจากนี้ จุดสูงสุดเนื่องจากการโค้งงอของน้ำเกิดขึ้นพร้อมกับตำแหน่งของจุดสูงสุดของเอไมด์ I และอาจมีขนาดใกล้เคียงกันสำหรับตัวอย่างที่มีน้ำปริมาณมาก เช่น เจลที่เป็นน้ำที่ศึกษาที่นี่ดังนั้นเราจึงไม่ได้พยายามที่จะสลายจุดสูงสุดของเอไมด์ I อย่างสมบูรณ์ และการสังเกตของเราควรได้รับการพิจารณาเพื่อสนับสนุนวิธีการอื่นเท่านั้น เช่น NMR สเปกโทรสโกปี
สารละลายของ NT 50 มก./มล. และ His-NT2RepCT ถูกเจลข้ามคืนที่ 37°Cจากนั้นไฮโดรเจลถูกเจือจางด้วย Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์ (pH 8) จนถึงความเข้มข้น 12.5 มก./มล. เขย่าให้เข้ากันและปิเปตเพื่อให้เจลแตกจากนั้น ไฮโดรเจลถูกเจือจาง 10 ครั้งด้วย Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์ (pH 8) จากนั้นตัวอย่าง 5 ไมโครลิตรถูกนำไปใช้กับตะแกรงทองแดงที่เคลือบด้วยฟอร์มวาร์ และตัวอย่างส่วนเกินถูกเอาออกด้วยกระดาษซับตัวอย่างถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำ MilliQ 5 ไมโครลิตรและย้อมด้วยรูปแบบยูรานิล 1% เป็นเวลา 5 นาทีขจัดคราบส่วนเกินด้วยกระดาษดูดซับ จากนั้นผึ่งตาข่ายให้แห้งการถ่ายภาพดำเนินการบนกริดเหล่านี้โดยใช้ FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ที่ทำงานที่ 100 kVภาพถูกบันทึกด้วยกำลังขยาย x 26,500 และ x 43,000 โดยใช้กล้อง CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, เยอรมนี)สำหรับแต่ละตัวอย่าง (n = 1) จะมีการบันทึกภาพ 10–15 ภาพImageJ (https://imagej.nih.gov/) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ภาพและการวัดเส้นผ่านศูนย์กลางของเส้นใย (n = 100, เส้นใยที่แตกต่างกัน)ปริซึม 9 ถูกใช้เพื่อทำการทดสอบทีแบบไม่มีคู่ (แบบสองด้าน)ค่าเฉลี่ย His-NT2RepCT และ NT fibrils คือ 11.43 (SD 2.035) และ 7.67 (SD 1.389) nm ตามลำดับช่วงความเชื่อมั่น (95%) คือ -4.246 ถึง -3.275องศาอิสระ = 198, p < 0.0001
ตัวอย่างของเหลว 80 µl ที่มีไทโอฟลาวิน T (ThT) 10 µM ถูกวัดเป็นสามเท่า (n = 3) ภายใต้สภาวะคงที่โดยใช้แผ่นด้านล่างใสด้านล่างสีดำของ Corning 96 หลุม (Corning Glass 3881, USA)ความแตกต่างของเรืองแสงถูกบันทึกโดยใช้ตัวกรองการกระตุ้น 440 นาโนเมตรและตัวกรองการปล่อย 480 นาโนเมตร (FLUOStar Galaxy จาก BMG Labtech, Offenburg, Germany)สัญญาณ ThT ไม่อิ่มตัวหรือดับลง เนื่องจากทำการทดลองที่มีความเข้มข้นต่างกันของ ThT โดยไม่เปลี่ยนความเข้มของสัญญาณบันทึกการดูดกลืนแสงที่ 360 นาโนเมตรสำหรับการวัดหมอกควันสำหรับการทดลองการเพาะเมล็ด เจล 100 มก./มล. ถูกสร้างขึ้นที่อุณหภูมิ 37° C. แล้วแขวนลอยใหม่ และใช้สำหรับการเพาะที่อัตราส่วนฟันกราม 5%, 10% และ 20%วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ปริซึม 9
ละลายสต๊อก His-NT2RepCT และ NT >100 มก./มล. บนน้ำแข็งและกรองผ่านตัวกรองขนาด 0.22 µmความเข้มข้นถูกคำนวณโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่ 280 นาโนเมตรโดยใช้นาโนดรอปในหลุมของเพลตที่ไม่มีสารยึดเกาะสีดำ 96 หลุม (Corning) ที่มีก้นใส ตัวอย่างถูกเจือจางเป็น 20 มก./มล. ใน Tris-HCl pH 8 20 มิลลิโมลาร์ และผสมกับ 5 μM ThT (ความเข้มข้นสุดท้าย) ความเข้มข้นของตัวอย่างทั้งหมด ปริมาตร 50 ไมโครลิตรตัวอย่างถูกถ่ายภาพทุกๆ 10 นาทีที่อุณหภูมิ 37 °C บนกล้องจุลทรรศน์ CellObserver (Zeiss) พร้อมช่องแสงที่ส่องผ่านและชุดตัวกรองการกระตุ้นและการปล่อย FITC สำหรับการถ่ายภาพ ThTเลนส์ 20x/0.4 ใช้สำหรับการถ่ายภาพใช้ Zen Blue (Zeiss) และ ImageJ (https://imagej.nih.gov/) สำหรับการวิเคราะห์ภาพเจลยังถูกเตรียมจากสารละลาย NT และ His-NT2RepCT ที่ความเข้มข้น 50 มก./มล. ที่มีทริส pH 8 และ 5 µM ThT 20 มิลลิโมลาร์ และบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 90 นาทีชิ้นเจลถูกย้ายไปยังหลุมใหม่ซึ่งประกอบด้วยทริส 20 มิลลิโมลาร์, pH 8 และ 5 ไมโครโมลาร์ ThT ในแผ่นด้านล่างใสสีดำ 96 หลุมที่ไม่มีการจับรับภาพเรืองแสงสีเขียวและภาพสนามสว่างที่กำลังขยาย 20x/0.4ImageJ ใช้สำหรับการวิเคราะห์ภาพ
สารละลาย NMR สเปกตรัมได้รับที่ 310 K บนสเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance Neo 600 MHz ที่ติดตั้ง QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN)ตัวอย่าง NMR ที่มีโปรตีนเนื้อเดียวกัน 10 มก./มล. ที่ติดฉลากด้วย 13C, 15N, ละลายใน Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์ (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .การเปลี่ยนแปลงทางเคมีของ NT2RepCT ที่ pH 6.7 ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดพีค 23 ในสเปกตรัม 2D ของ 15N-HSQC
สเปกตรัมของแข็ง NMR (MAS) ที่หมุนด้วยมุมมหัศจรรย์ของไฮโดรเจลที่มีฉลาก 13C, 15N ถูกบันทึกไว้บนสเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance III HD ที่ 800 MHz พร้อมกับโพรบไร้อิเล็กตรอน 3.2 มม. 13C/15N{1H}อุณหภูมิตัวอย่างถูกควบคุมโดยใช้กระแสก๊าซอุณหภูมิแปรผันที่ 277 K ได้สเปกตรัมเรโซแนนซ์การหมุนไดโพลสองมิติ (DARR) 76 และการเชื่อมต่อความถี่วิทยุ (RFDR) 77 สเปกตรัมที่ความถี่ MAS 12.5 kHz และ 20 kHz ตามลำดับโพลาไรซ์แบบไขว้ (CP) จาก 1H ถึง 13C ดำเนินการโดยใช้ทางลาดเชิงเส้นจาก 60.0 ถึง 48.0 kHz ที่ 1H, 61.3/71.6 kHz ที่ 13C (ที่ 12.5/20 kHz MAS) และเวลาสัมผัส 0.5–1 msใช้การแยก Spinal6478 ที่ 73.5 kHz ในระหว่างการรวบรวมข้อมูลเวลาในการรับข้อมูลคือ 10 มิลลิวินาที และความล่าช้าของวงจรคือ 2.5 วินาทีความสัมพันธ์ของ Cα/Cβ แบบเชื่อมโยงเดี่ยวที่สังเกตได้ในสเปกตรัม RFDR ถูกกำหนดโดยอิงตามการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของชนิดเรซิดิวที่มีลักษณะเฉพาะและความสัมพันธ์แบบทวีคูณในสเปกตรัม DARR
ฐานข้อมูล Zipper79 (//services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินแนวโน้มการกระพือปีกและพลังงาน Rosetta สำหรับ NT, NTFlSp และ NTMiSpฐานข้อมูล Zipper คำนวณ Rosetta Energy80 ซึ่งรวมฟังก์ชันพลังงานอิสระหลายอย่างเพื่อสร้างแบบจำลองและวิเคราะห์โครงสร้างโปรตีนระดับพลังงานที่ -23 กิโลแคลอรี/โมลหรือต่ำกว่า บ่งชี้ว่ามีแนวโน้มที่จะเกิดภาวะ fibrillation สูงพลังงานที่ลดลงหมายถึงความเสถียรของเส้นใย β ทั้งสองเส้นในโครงสร้างซิปที่มากขึ้นนอกจากนี้ อัลกอริธึม Waltz ยังใช้ในการทำนายบริเวณอะไมลอยด์เจนิกใน NT, NTFlSp และ NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
สารละลายโปรตีน NT ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ 2-(N-มอร์โฟลิโน)อีเทนซัลโฟนิก (MES) ที่ pH 5.5 และ 6.0 เพื่อลด pH ลงเหลือ pH 6 และ 7 ตามลำดับความเข้มข้นของโปรตีนสุดท้ายคือ 100 มก./มล.
ทำการวัดบน J-1500 CD สเปกโตรมิเตอร์ (JASCO, USA) โดยใช้คิวเวตต์ 300 μL ที่มีเส้นทางแสง 0.1 ซม.โปรตีนถูกเจือจางจนถึง 10 ไมโครโมลาร์ (n = 1) ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 20 มิลลิโมลาร์ (pH 8)เพื่อวิเคราะห์ความคงตัวของโปรตีนเมื่อมีเกลืออยู่ โปรตีนถูกวิเคราะห์ที่ความเข้มข้นเดียวกัน (n = 1) ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 20 มิลลิโมลาร์ (pH 8) ที่มี NaF หรือ NaCl 154 มิลลิโมลาร์ ตามลำดับการสแกนอุณหภูมิถูกบันทึกที่ 222 นาโนเมตร จาก 25°C ถึง 95°C ด้วยอัตราการทำความร้อนที่ 1°C/นาทีสัดส่วนของโปรตีนที่ถูกพับโดยธรรมชาติถูกคำนวณโดยใช้สูตร (การวัด KD – KDfinal)/(KDstart – KDfinal)นอกจากนี้ ห้าสเปกตรัมถูกบันทึกสำหรับแต่ละตัวอย่างตั้งแต่ 260 นาโนเมตรถึง 190 นาโนเมตรที่ 25°C และหลังการให้ความร้อนจนถึง 95°Cสเปกตรัมห้าตัวถูกหาค่าเฉลี่ย ปรับให้เรียบ และแปลงเป็นรูปวงรีของฟันกรามวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ปริซึม 9
ความเข้มของแสงเรืองแสงของ His-NT-GFP (300 มก./มล., 80 µL) วัดเป็นสามเท่า (n = 3) ในเพลต Corning 96 หลุมที่มีก้นโปร่งใสสีดำ (Corning Glass 3881, USA) ภายใต้สภาวะคงที่วัดตัวอย่างด้วยเครื่องอ่านเพลทแบบเรืองแสงที่มีความยาวคลื่นกระตุ้น 395 นาโนเมตร และบันทึกการแผ่รังสีที่ 509 นาโนเมตรก่อนเกิดเจลและ 2 ชั่วโมงต่อมาที่อุณหภูมิ 37°Cวิเคราะห์ข้อมูลด้วยปริซึม 9
ใช้ชุดทดสอบกิจกรรมของพิวรีนนิวคลีโอไซด์ฟอสโฟรีเลส (วิธีฟลูออโรเมตริก, Sigma Aldrich) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตในการวัดกิจกรรมในเจลและสารละลายที่มี His-NT-PNP ให้ผสม His-NT-PNP 10 นาโนกรัมกับ NT 100 มก./มล. จนได้ปริมาตรรวม 2 µL เนื่องจากเจลให้สัญญาณสูงกว่าช่วงการตรวจจับของชุดมีการควบคุมเจลและสารละลายที่ไม่มี His-NT-PNP รวมอยู่ด้วยทำการวัดสองครั้ง (n = 2)หลังจากตรวจวัดแอคติวิตีแล้ว ส่วนผสมของปฏิกิริยาจะถูกเอาออกและถ่ายภาพเจลเพื่อให้แน่ใจว่าเจลยังคงสภาพสมบูรณ์ในระหว่างการตรวจวัดวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ปริซึม 9
หากต้องการข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา โปรดดูบทคัดย่อการศึกษาธรรมชาติที่เชื่อมโยงกับบทความนี้
รูปที่ 1 และ 2 แสดงข้อมูลเริ่มต้น1c, 2a – c, 3a, b, e – g, 4, 5b, d, f และ 6, มะเดื่อเสริม3 มะเดื่อเสริม5a, d, รูปที่เสริม6 และรูปเสริม8. ข้อมูลจากการศึกษานี้โฮสต์อยู่ในฐานข้อมูล Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653ข้อมูล NMR ที่ได้รับในการศึกษานี้ถูกโพสต์ไปยังพื้นที่เก็บข้อมูล BMRBig ภายใต้ ID รายการ bmrbig36โครงสร้างของ GFP และ PNP ถูกนำมาจาก PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2)
Rising, A. และ Johansson, J. ปั่นใยแมงมุมเทียมเคมีแห่งชาติ.ชีววิทยา.11, 309–315 (2015)
Babb, PL และคณะจีโนมของ Nephila clavipes เน้นย้ำถึงความหลากหลายของยีนไหมแมงมุมและการแสดงออกที่ซับซ้อนเจเน็ตแห่งชาติ.49, 895–903 (2017)